Особенное негодование князя Константина вызвало тайное, без обсуждения православной общественностью, заключение Брестской унии. В широко распространенном письме он провозгласил инициаторов унии «волками в овечьей шкуре», предавшими свою паству, и призывал верующих к открытому противостоянию. Послав официальный протест королю Сигизмунду III (который его проигнорировал), Константин Острожский вступил в антикатолический союз с польскими протестантами, угрожая поднять вооруженное восстание. Под его влиянием оставшаяся верной православию шляхта (часть которой уже входила в круги формировавшегося казачества) собиралась на уездные (волостные) сеймы и высказывалась против унии. Ведущие монастыри, и прежде всего Киево-Печерская лавра, которую в то время возглавлял ярый ревнитель православия Никифор Тур, решительно отвергли унию и предали проклятию ее инициаторов.

Этими решительными действиями Константину Острожскому совместно с друзьями и сподвижниками (Никифором Туром, Иваном Вишенским, острожским шляхтичем Мартином Броневским, писавшим под псевдонимом Христофор Филалет и др.) удалось во многом сорвать планы приведения в состояние унии всего украинско-белорусского православия. В 90-х годах XVI века в Украине появляется целое направление религиозно-полемической литературы, достигшее своего расцвета в следующие десятилетия.

Однако на православных землях польско-литовского государства возможности противостоять униатству и католическому давлению были не у всех одинаковыми. В ближайшей к Польше Галиции и на большей части Волыни позиции католицизма к концу XVI века были уже весьма сильны и власть принадлежала католикам, в том числе из знатных западно-украинских родов. Но Среднее Поднепровье было затронуто польско-католическим влиянием еще относительно мало. Более того, пост киевского воеводы сохранял за собой приверженец православия Константин Острожский.

Это не позволяло сторонникам унии широко (как в Галиции или Литве) предпринимать в Киеве и округе насильственные действия против православных. Подчинению папе здесь решительно противились все сословия, в особенности само духовенство, казаки и горожане.

Стоит сказать и о меценатской деятельности князя Острожского в поддержку православной церкви. В Киеве благодаря его заботам и материальной помощи были восстановлены Кирилловский и Межигорский монастыри, нового расцвета достигла Киево-Печерская лавра, на Подоле были построены церкви Николы Доброго и Рождественско-Предтечинская. По преданию, он был патроном более 1000 православных церквей по всей Украине.

Меценатство, издательская деятельность и политическое заступничество Константина Константиновича, его неутомимая просветительская работа помогли украинскому православию выстоять и окрепнуть в годы католического давления и насаждения униатства.

Однако процесс окатоличивания и полонизации украинско-белорусской аристократии приобретал необратимый характер. В католицизм переходили некогда известнейшие православные княжеские дома. Более того, еще при жизни Константина-Василия его дети тоже перешли в католицизм, а единственный оставшийся верным православию сын Александр умер раньше отца.

В XVII веке на авансцену украинской истории выходят новые, сохранявшие верность православию, социально активные слои — горожане (мещане) и духовенство, главным образом самого Киева, а также становящееся грозной военной силой запорожское казачество.

Ситуация, сложившаяся на украинско-белорусских землях в результате принятия верхушкой церковной иерархии Брестской унии 1596 года, породила глубокие противоречия в настроениях верующих. Особенно это относилось к образованной части православных в пределах польско-литовского государства.

На стороне униатства были сила, власть и деньги. Но, может быть, главное заключалось в том, что православие, каким оно было в XVI веке у восточнославянских народов и на Балканах, едва ли не во всем (кроме разве что глубины мистического опыта отдельных иноков и иконописи) уступало католицизму. Здесь не было ни упорядоченной догматики, ни разработанной теологии, ни дополнявших и углублявших богословие философских систем, ни сколько-нибудь развитой литературной традиции, ни налаженной системы образования.

Большинство представителей духовенства, мирян Украины и Белоруссии категорически не желало принятия унии, подчинения папскому престолу. Однако им трудно было обоснованно и доказательно противопоставить схоластически отработанной догматике католицизма истины восточной церкви.

Православная патриотическая традиция не развивалась, по сути, с IX века, а тот всплеск духовной активности XIII–XIV веков, который условно называют «византийским гуманизмом», на культуру славянских народов заметного влияния не оказал. До начала XVII века внимание акцентировалось не на культуре разума и просвещения (которые все более утверждались в Западной Европе), а на глубине личных мистических переживаний, не нуждавшихся в их рационально-образном обосновании и представлении.

Поэтому душой не принимавшие унии образованные и чуткие в нравственном отношении приверженцы православия в XVI — начале XVII века осознавали, что теоретически они мало что могут противопоставить стройной архитектонике католицизма. Католическое насилие, как и униатское подчинение папскому престолу, вызывали у них протест. Но оспаривать аргументы, не имея своей равной по масштабу богословско-философской системы, было трудно.

Поэтому в развернувшейся полемике с униатством и католицизмом многие из наиболее талантливых, образованных и впечатлительных ее участников оказались в двойственном положении. Они стремились к примирению противоборствующих сил и в течение жизни примыкали, причем искренне, в соответствии с изменениями своих убеждений, к той или другой стороне. Наиболее ярким тому примером является выдающийся украинский филолог, писатель-полемист, просветитель и церковный деятель Максим Смотрицкий, более известный под своим монашеским именем Мелетий.

М. Смотрицкий родился по одним данным около 1572 года, а по другим — в 1578 году в православной шляхетской семье. Его отец, Герасим Смотрицкий, был высокообразованным человеком, владел, кроме книжного украинского и церковнославянского, также польским, древнегреческим языками, латынью. До 1576 года он занимал пост городского писаря при магистрате в Каменце-Подольском, а затем был приглашен известным меценатом и ревнителем православия, князем Константином-Василием Острожским в его резиденцию на Волынь.

Герасим Смотрицкий вскоре стал идейным лидером собравшегося вокруг князя Константина кружка православных культурных деятелей и в 1580 году возглавил Острожскую коллегию (академию). Уже в первые годы своего пребывания в Остроге он издал «Букварь» для братских школ Украины. Параллельно он возглавил работу по подготовке издания первой славянской Библии, которая печаталась в Острожской типографии покинувшим пределы Московского царства И. Федоровым (Федоровичем). Г. Смотрицкий написал к этому изданию стихотворный пролог, сделал большую часть переводов канонических текстов с греческого на церковнославянский, сверив их с латинским образцом, осуществил общую редакцию текста.

Издание «Острожской Библии» стало главным делом жизни Г. Смотрицкого. В обстановке усиливавшегося католического давления он не мог быть в стороне от острых религиозных споров своего времени. В 1587 году отец Мелетия опубликовал «Ключ Царства Небесного и нашей христианской духовной власти нерушимый узел» и «Календарь римский новый». В те же годы он написал еще много полемических и сатирических произведений, направленных против иезуитской пропаганды. Особенной критике в них подвергалось католическое учение о божественном происхождении папской власти.