В 1453 г. турки-османы после продолжительной и кровопролитной осады захватили Константинополь (при этом погиб в бою последний византийский автократор). Родосское государство иоаннитов осталось последним серьезным противником турок в Восточном Средиземноморье. Теперь и рыцари Родоса окончательно уяснили себе – враг у ворот! Теперь и для них началась борьба не на жизнь, а на смерть. Осознание этого иоаннитами выразилось, в частности, в титанических усилиях Великих Магистров, направленных на то, чтобы максимально укрепить фортификационные сооружения столицы и гаваней Родоса, усилить прочие крепости, расположенные как на острове за пределами столицы, так и на других островах, относившихся к числу орденских владений, расширить склады продовольствия, вооружения и боеприпасов. Путем издания соответствующих законов Орден пытался создать, хотя бы в общих чертах, план обороны города и селений. В 1465 г. Великий Магистр П.Р. Закоста разделил крепостные стены столицы Родоса на участки, каждый из которых надлежало оборонять одному из «языков» Ордена. К 1467 г. иоанниты возвели на Родосе много новых укреплений. Были выкопаны дополнительные рвы и сооружена новая стометровая стена высотой до 10 м. В 1474 г. Джованни Батиста дельи Орсини, а в 1479 г. - Пьер д’ Обюссон определили, в каких крепостях надлежит укрыться сельскому населению Родоса в случае вражеского нападения.

В ожидании турецкого нашествия рыцари Родоса предпринимали все возможное для выигрыша времени. В 1455 г. Орден Святого Иоанна отправил посольство к Адрианополь к султану Мехмету II Завоевателю для ведения мирных переговоров. Но Мехмет II, в качестве «цены мира», потребовал от иоаннитов уплаты дани в размере 2000 дукатов ежегодно и признания верховного суверенитета султана над Родосом. Великий Магистр с согласия Совета отвечал ему, что корпус Ордена состоит из воинов-монахов, подчиненных христианскому первосвященнику-папе, что рыцари приобрели остров Родос ценой своей крови, и что все члены Ордена с радостью пожертвуют жизнью для защиты Христианского Закона. В ответ на этот дерзкий, с точки зрения турок, отказ турецкая флотилия из 30 галер в 1456 г. напала на принадлежавшие Ордену Святого Иоанна острова Кос и Сими.  В 1457 г. турки внезапно высадились на востоке острова Родос и разграбили селение Архангелос. Иоанниты контратаковали турок, многих перебили и взяли в плен, а остальных вынудили вернуться на свои корабли и удалиться. Вскоре турецким нападениям подверглись и другие островные владения рыцарей Родоса – Тилос, Нисирос, Лерос и Калимнос. По распоряжению Великого Магистра все жители мелких островов были эвакуированы на Родос, чтобы, с одной стороны, спасти их от угрозы верной смерти или продажи в рабство, а с другой – увеличить за их счет число защитников главного острова архипелага, на который были стянуты все боеспособные силы Додеканеса.

И без того угрожающее положение, в котором оказалось государство рыцарей Родоса, дополнительно усугублялось распрями, вспыхнувшими между Орденом и Венецианской республикой. Отношения между Родосом и Венецией, как двумя крупными средиземноморскими державами, никогда не были особенно дружественными, но до поры-до времени не доходили до вооруженных столкновений. Мало того – обе державы достаточно часто, особенно в XIV в., плечом к плечу сражались на суше и на море против общего врага – мусульман. Но теперь между ними вспыхнула почти открытая война.

Начало этой распре было положено смертью короля Кипрского Жана III де Лузиньяна. После смерти короля на кипрский трон одновременно претендовали его законная дочь Карлотта и его незаконный сын Иаков. Орден рыцарей Родоса встал в этом споре на сторону принцессы Карлотты. Бастарда Иакова поддержал султан Египта. Иаков одержал верх, и Карлотта, потерпев поражение, бежала к иоаннитам на Родос. Иакова поддержала также Венеция (он был женат на венецианской патрицианке Катарине ди Корнаро). Скрытая вражда между Венецией и Орденом Святого Иоанна приняла форму неприкрытой вооруженной борьбы, когда рыцари Родоса в 1460 г. захватили две венецианские галеры, имевшие на борту египетских купцов, везших в Венецию дорогие товары. Узнав об этом инциденте, венецианский капитан Луиджи Лоредано напал на Родос, разграбил там несколько селений и потребовал от Ордена освободить всех пленников и вернуть захваченные товары их законным владельцам. После долгих переговоров, проходивших в крайне напряженной обстановке, рыцарям Родоса пришлось удовлетворить все требования венецианцев, чтобы избежать крупномасштабного вооруженного конфликта.

Испортив отношения с Венецией, Орден попытался предпринять новые шаги к примирению с турками. Но последние снова потребовали от Ордена, в качестве условия, уплаты ежегодной дани. Это требование было снова отклонено рыцарями Родоса, как неприемлемое. Обе стороны продолжали готовиться к предстоящему столкновению. Эти приготовления стали еще более интенсивными после захвата турками Митилены.

Родосские рыцари находились в тяжелейшем положении. Сельские районы за городом Родосом и территория других островов Додеканеса, подвергавшиеся постоянным нападениям мусульман (а вдобавок к ним – еще и венецианцев!). Деревни были сожжены дотла, угодья опустошены. Разоренные крестьяне больше не могли платить Ордену оброка – ни натурой, ни деньгами. В результате, Орден Святого Иоанна страдал от нехватки денег и продуктов питания. Кроме запасов продовольствия, не хватало вооружения, артиллерийских орудий и боеприпасов к ним. Фортификационные сооружения столицы Родоса и прочих крепостей, в том числе и на  других островах архипелага, нуждались в срочном укреплении и ремонте. Но ремонтные работы также требовали больших денег. Хотя Орден еще в 1462 г. обложил все импортируемые товары дополнительным двухпроцентным «цепным налогом» (называвшимся так потому, что взимался с торговых кораблей при входе в гавань, перегороженную огромной железной цепью), иоаннитам не хватало денег на покрытие всех расходов – даже текущих! Великий Магистр неустанно требовал материальной и финансовой помощи Родосу от европейских филиалов Ордена. В 1470 г. турки захватили принадлежавший Ордену остров Эвбею. На очереди стояло завоевание ими Родоса! К счастью для pодосских рыцарей, султан Мехмет II был отвлечен необходимостью ведения войны в Далмации и Персии. Шах Персидский, увязнув в войне с османами, попросил Орден Святого Иоанна о военной помощи. И рыцари решили ему эту помощь оказать, хотя он был мусульманином (правда, в отличие от турок и тогдашних египтян, не суннитом, а шиитом).

Военные приготовления Ордена шли во все убыстряющемся темпе. Великий Магистр Джованни Батиста дельи Орсини, у которого угроза турецкого нападения превратилась в «идею фикс», определил, кому из рыцарей предстоит оборонять башню Святого Николая (иногда именуемый в литературы «фортом Санкт-Николас»), а кому – Мельничный Мол, также усиленный мощной крепостной башней. Он обязал каждый «язык» Ордена за собственный счет расширить и дополнительно укрепить тот участок крепостной стены, который данному «языку» было поручено оборонять. Общий надзор над фортификационными работами был поручен Пьеру д’Обюссону, обладавшему необходимыми техническими знаниями и навыками. После избрания д’Обюссона Великим Магистром фортификационные работы стали проводиться в еще более усиленном темпе и объеме. Д’Обюссон не только укреплял крепостные стены, увеличивал запасы всего необходимого, усиливал гарнизоны опытными воинами из Западной Европы, но и поддерживал секретные дипломатические отношения с султанами Египта и Туниса, чтобы избежать концентрического окружения Родоса. В 1477 г. Орден заключил торговый договор с египетским, а в 1478 г. – с тунисским султаном.

В 1478 г. Софианос (Суфьян), губернатор расположенной напротив Родоса малоазиатской провинции Османской державы, прибыл на Родос в качестве посланника принца Джема (Джиджима или Зизима), младшего сына турецкого султана Мехмета II. Были начаты переговоры. Однако ни турки, ни рыцари Родоса не верили всерьез в возможность мирного завершения нараставшего конфликта. Обе стороны надеялись лишь выиграть время, чтобы завершить свои военные приготовления.