Победив папство, королева не добилась спокойной жизни. Набирало силу движение пуритан, которые угрожали переделать епископальную государственную Церковь в пресвитерианскую или конгрегационалистскую. Пуритане утверждали, что в Англиканской Церкви все еще остается слишком много «отбросов папства», и хотели «очистить» ее в соответствии с Библией, которую они признавали непогрешимым правилом веры и жизни. Это желание привело к тому, что после 1560 года их стали называть пуританами (лат. purus — «чистый»). Вплоть до 1570 года их главные усилия были направлены против продолжавшегося использования в литургии Церкви обрядов и одеяний, которые казались им папистскими. Они возражали против святых дней, духовного отпущения грехов, против креста, обычая при крещении иметь крестных, опускаться на колени во время причащения и использовать стихарь служителями. Они также отрицали плохое соблюдение воскресения англиканами. Они шли в русле толкований Кальвина, сделанных Вильямом Эймсом (1576–1633) и Вильямом Перкинсом. Кембридж стал университетским центром, где пуритане приобрели самое большое влияние.

Пуританизм продолжал расти и получил поддержку многих адвокатов, купцов и сельского дворянства. После того как исчезла угроза со стороны папы, Елизавета в 1593 году приняла акт против пуритан. Этот акт давал властям право заключать в тюрьму пуритан за непосещение Англиканской Церкви. Следует помнить, что пуритане были не сектантами, а партией в Англиканской Церкви, которая в случае с Картрайтом и его последователями стремилась создать пресвитерианскую государственную Церковь, а Джекоб и его последователи стремились к конгрегационалистской государственной Церкви. Последняя группа сформировала группу пуритан известную как индепенденты (независимые). Индепендентов следует отличать от сепаратистов, которые хотели разделения церкви и государства и конгрегационного управления Церковью. Обе группы продолжали расти, несмотря на оппозицию короны, и вели здоровую критику Английской Церкви. Ими осуждались излишества в одеяниях, отсутствие усердия в соблюдении воскресения и отсутствие осознания греха. Корни английских конформистских сект и конгрегационализма Новой Англии уходят в пуританское движение.

За несколько лет до смерти Ричард Хукер (ок. 1554–1600), пытаясь противостоять угрозе пуритан государственной Церкви, сочинил «Трактат о законах церковной политики», работу, по сути, философскую, где утверждал, что закон, данный Богом и обнаруживаемый рассудком, является верховным. Подчинение правителю, который правит по согласию народа и в соответствии с законом, является необходимым, ибо правитель является главой как государства, так и Церкви. Граждане государства также являются членами государственной церкви и в обеих сферах подчинен Божественному закону. Епископы, подчиненные королю, должны осуществлять надзор над государственной Церковью. Хукер выражал несогласие как с тенденцией пуритан отделить Церковь от государства, так и с папскими претензиями на власть над государством. Не стоит удивляться, что пуританские богословы осуждали его взгляды, поскольку полагали, что люди, находящиеся под Богом, являются источником суверенности в Церкви.

Благодаря Томасу Картрайту (1535–1603), профессору богословия Кембриджского университета, примерно в 1570 году пуританские усилия переместились с реформы литургии на реформу в богословии и церковном управлении. Утверждение Картрайтом конечного авторитета Писаний привело его последователей к признанию кальвинистического богословия, что сделало «Тридцать девять статей» еще более кальвинистическими. В своих лекциях по книге Деяний в 1570 году Картрайт осуждал управление епископами. Управление Церковью должно находиться под контролем пресвитериата из епископов или пресвитеров, которые исполняли одни только духовные функции. Эта система является, по сути, своей кальвинистической системой церковного управления пресвитерами, которые избираются конгрегацией. Позже Картрайт перевел сочинение Вальтера Траверса «Церковные наставления», который выступал за образование пресвитериата в каждом диоцезе церкви. Картрайт заложил основы английского пресвитерианства, которое было довольно влиятельным с 1643 по 1648 год. Пресвитерианство современной Англии обязано своим существованием его работе. Первая Пресвитерианская Церковь образовалась в Вондсворте в 1572 году.

Часть пуритан, которые не последовали пресвитерианскому образцу Картрайта, приняли взгляды Джекоба (1563–1624). Джекоба можно считать основателем индепендентов, или пуританских конгрегационалистов. Индепенденты были не так склонны к сепаратизму, как последователи Роберта Брауна, который делал упор на церковный завет как звено, связывающее вместе христиан. Джекоб был одним из тех, кто подписал «Тысячелетнюю петицию» Якову I в 1603 году, которая просила отказаться от епископата в Англии. Его бросили в тюрьму за убеждение, что каждая конгрегация должна быть свободна в государственной церкви выбирать своего собственного пастора, определять свою политику и управлять своими делами. Примерно в 1606 году Джекоб уехал в Голландию и стал служителем у англичан в Мидлбурге. Джон Робинсон, пастор сепаратистской конгрегации в Голландии, члены которой позже эмигрировали в Плимут, и Джекоб оказали значительное влияние друг на друга. Джекоб вернулся в Англию в 1616 году и был пастором конгрегации индепендентов в Саутворке около Лондона с 1616 по 1622 год. Индепенденты, или конгрегационалистские пуритане, в Англии развивались медленно, однако при Оливере Кромвеле они стали более могущественны, чем пресвитериане. Кромвель и Мильтон были индепендентами.

В 1658 году в Савойе в Лондоне конгрегационалистские последователи Джекоба и сепаратистские конгрегации сформулировали кальвинистский символ веры, известный как «Савойская декларация». Английский конгрегационализм является скорее линейным наследником этого пуританского конгрегационализма, чем сепаратистского конгрегационализма Роберта Брауна.

Основным различием между епископальными, пресвитерианскими и независимыми пуританами (которые описывались до настоящего времени) и сепаратистскими пуританами является взгляд на церковный завет. Сепаратисты связывают себя обязательством подчинения Христу и друг другу вне государственной Церкви. Схема дает некоторые представление о развитии различных пуританских групп (см. с. 193).

Самая первая группа сепаратистов, которые основали Церковь, основанную на завете, была организована Ричардом Фитсом примерно в 1567 году. Роберт Браун (ок. 1550–1633), который окончил Кембриджский университет в 1572 году, собрал группу под церковным заветом в Норвиче в 1580 или 1581 году. Оттуда он был вынужден бежать с его конгрегацией в Голландию, где написал три трактата, выработав принципы сепаратистского конгрегационализма. Самый важный из них назывался «Реформация как она есть». В этом сочинении в 1582 году Браун утверждал, что верующие должны быть объединены с Христом и друг с другом добровольным заветом, что служители должны избираться членами Церкви и что ни одна конгрегация не должна иметь власти над другой. В отличие от независимых конгрегационалистов, сепаратисты не желали иметь ничего общего с государственной Церковью. Браун вернулся в Англию и в 1591 году был рукоположен в Англиканской Церкви, где он и служил до смерти, но великие принципы, которые он разработал, продолжали жить и после его смерти.

Передовые взгляды Брауна на конгрегационализм были несколько модифицированы конгрегацией, которая возникла в Лондоне примерно в 1586 году под предводительством Джона Гринвуда и Генри Барроу (оба были повешены в 1593 году властями за их взгляды). Фэнсис Джонсон стал пастором у их приверженцев, которые эмигрировали в Голландию. К 1640 году в Англии осталось лишь несколько сот этих «барроуистов».