Наиболее трудной задачей на этом этапе является получение стерильного материала — применительно к микропропагации такой материал называется эксплантат.

Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяются хлорсодержащие вещества (гипохлорит натрия — 1 — 1,4%; гипохлорит кальция — 7 — 10%; хлорамин —2 — 10%); ртутьсодержащие вещества (сулема 0,1%; диацид); перекись водорода (2 — 10%); этиловый спирт (70 — 75%). Кактусоводу придется подбирать вид и концентрацию этих веществ опытным путем,т.к. разные экземпляры кактусов даже одного ботанического наименования и, естественно, их ткани неодинаково реагируют на воздействие различных стерилизующих веществ. Ориентироваться можно на следующие показатели:

Органы растений

Время стерилизации, мин.

гипохлорит натрия

или кальция

1       сулема

Семена

20

10

Выделенные из семян зародыши

10—15

5

Незрелые зародыши

3 — 5

1—3

Апикальная меристема

5 — 10

3 — 5

Меристема боковых вегетативных точек

10—15

3—10

Камбий от 1 — 2-х месячных сеянцев

3 — 5

1—3

Камбий из верхней части стебля

10—15

8— 10

Камбий из одревесневшей

 части стелы

20

15 — 20

Раневая каллюсная меристема

2 _ 5

1

Кактус, предназначенный к операции, моют с применением перманганата калия, высушивают, удаляют с поля операции опушение ареолы и обрезают колючки, стараясь при этом не выламывать их, т.к. это может травмировать меристематическую ткань ареолы, что, в свою очередь, ставит под сомнение успех микроразмножения из ареолярной меристемы.

Сегмент стебля вырезают и помещают в стерилизующий раствор. Через заранее определенное время эксплантат вынимают и помещают в стакан с дистиллированной или дважды прокипяченной водой, выдерживают 10 минут, меняют воду еще два раза и выдерживают в каждой порции 15 — 20 минут.

Мелкий материал: семена, ареолы — помещают в марлевый мешочек, который завязывают ниткой и стерилизуют аналогичным способом. Семена предварительно обрабатывают спиртом, затем — дезинфицирующим веществом и оставляют до набухания в стерильной чашке Петри. После суточного интервала семена стерилизуют повторно.

Начальная стадия микроразмножения

Через откидную дверцу в бокс ставят спиртовку или свечи, сосуды с искусственной питательной средой, кладут спички, режущий инструмент, завернутый в бумагу, стерильные чашки Петри и фильтровальную бумагу, емкость для отработанного материала. Дверцу закрывают и бокс облучают ультрафиолетом в течении получаса. Еще через полчаса в бокс кладут подготовленный растительный материал под стеклянным колпаком, тщательно закрывают дверцу бокса и повторяют облучение ультрафиолетом в течение 10 — 15 минут. По истечении этого срока комнату проветривают и приступают к посеву.

Прежде всего зажигают спиртовку (можно использовать сухое горючее) или свечи. Вокруг горящего пламени спиртовки создается стерильная сфера диаметром 20 — 30 см, от пламени свечи — до 15 см, поэтому при использовании свечей их ставят вокруг операционного поля.

Подготовленный эксплантатный материал помещают на фильтровальную бумагу или в чашки Петри и обрезают лишние ткани, особенно это относится к сегментам стебля. Сеянцы с предварительно удаленными корнями и колючками разрезают вдоль.

При наличии практики с семян удаляют кожуру, но можно применять и нешелушеные семена либо, что лучше — стерилизованные суточные проростки.

Эксплантаты переносят на питательную среду и слегка вдавливают в агар. Посуду со средой и крышки проносят над пламенем, не обжигая при этом эксплантаты, закрывают и оставляют в боксе в темноте при температуре около +26 °С и влажности воздуха около 10%*.

Получение каллюсной культуры

Примерно на 8 — 10-й день после посева происходит разрастание каллюсной массы, позволяющее выделить наиболее активно растущие участки. Через 3 — 4 недели такие части каллюсной меристемы отделяют и сеют в другую посуду. Эти манипуляции называют субкультивированием.

* вж1жпостн1>1е параметры а замкнутых сосудах при такой температуре соответствуют данным требованиям.

Фото 451. Побеги Ferocactus acanthoides из акси-лярного каллюса после  65-тидневного культивирования на модернизированной среде Мурасиге-Скуга с содержанием 5,4 мг/л ИУК и 46,5 мг/л кинетика.

(по J.Ault и J.Blackmon)

Фото 452. Побеги Leuchtenbergiaprincipis из апикального каллюса после 6-ти месяцев культивирования на модернизированной среде Мурасиге-Скуга с содержанием 10 мг/л ИУК и 100 мг/л БАП.

(по R.Starling)

Следует помнить, что работать целесообразнее с выделенной и отобранной культурой, т.к. эта часть каллюсной меристемы наиболее приспособлена к росту на данной конкретной среде. При строго научном подходе выделение активно растущих участков ткани проводят еще 8 — 10 раз, но в прикладном аспекте эти мероприятия излишни, и уже с первично выделенным каллюсом можно работать.

На первоначальных этапах при росте каллюсной меристемы следует учитывать фактор соотношения ауксиновых и цитокининовых гормонов в питательной среде. Напомню, что это соотношение следует выдерживать 10:1 (2,0 — 3,0 мг/л ауксина, 0,2 — 0,3 мг/л кинетина). При нарастании достаточного количества каллюсной массы (примерно через 6 — 8 недель) ее делят на несколько кусочков, которые переносят в отдельную посуду на свежую среду с большим содержанием цитокининовых гормонов.

Фото 453. Клоны из аксиллярного каллюса Pediocactus knowltonii на среде Мурасиге-Скуга с содержанием 114 мг/л ИУК и 228 мг/л зеатина.

(по Ph.Clayton, J.Hubstenberg, G.Phillips)

Фото 454. Корнеобразование у клона Ferocactus acanthoides через 95 дней после субкультивирования на безгормональной среде Мурасиге-Скуга. (по J.Ault и J.Blackmon)

По результатам опытов Р.Старлинга, Дж. Аулта и В.Блакмона, Ф.Клайтона и др. (в том числе и автора) максимальное побегообразование на каллюсной меристеме наблюдалось при культивировании на средах с равным (10 мг/л ауксина и 10 мг/л цитокинина) или обратным первоначальному соотношением ауксинов и цитокининов 1 : 10 (в различных опытах 0 — 10 мг/л ауксина, 10 — 100 мг/л цитокинина). Это естественно, т.к. цитокинины стимулируют побегообразование, в то время как ауксины тормозят его.

После развития хорошо сформированных побегов их отделяют и высаживают на среды с повышенным содержанием ауксинового гормона, что стимулирует закладывание и рост корней.

Аулту и Блакмону удалось добиться 90% сохранности полученных растений (Ferocactus acanthoid.es) при переводе их в корнесобственную культуру. В качестве субстрата применялась смесь из 2 частей перлита, 1 части верхового торфа, 1 части хорошо измельченной еловой коры, взятых по объему. Автору же не удалось получить более 30% сохранности растений при переводе их на аналогичный и более легкий субстрат. При переводе молодых растений на гидропонную среду* сохранность приближалась к 80%. Гораздо удачнее оказались опыты по привитию клонированных кактусов, еще не сформировавших корневой системы, на молодые перескиопсисы. Сохранность привитых растений приближалась к 90%, а при переводе их в корнесобственную культуру через год после привития удавалось получить до 80% молодых растений от первоначального количества клонов. Отход клонированных растений можно объяснить прежде всего недостатком живительных солнечных лучей в регионе Москвы и севернее, и невозможностью предоставления молодым активно-растущим кактусам необходимых условий при культивировании их под искусственным освещением.