7000

Наиболее же часто употребляется среда Мурасиге-Скуга (Murashige-Skoog).

На первый взгляд рецепты довольно сложные, и не представляется возможности приобрести некоторые ингредиенты. Поэтому стоит подробнее остановиться на компонентах наиболее популярной питательной среды Мурасиге-Скуга:

NH4NO3 — аммиачная селитра — довольно широко применяемое минеральное удобрение;

KNO3 — калийная селитра, тоже применяется в качестве минерального удобрения;

КН2РО4 — суперфосфат;

СаС12 • 2Н,О — хлористый кальций можно приобрести в виде 10%-го раствора или в виде таблеток в аптеке;

MgSO4 • 7Н2О применяют в качестве минерального удобрений;

соли железа применяются при обработке фотоматериалов;

соли микроэлементов выпускаются в комплексах как микроудобрения, их рецептурный состав может незначительно варьировать, но заметного отрицательного влияния это не имеет;

в качестве органических добавок можно использовать вытяжки из культуры дрожжей, эндосперма конского каштана, плодов фасоли. Вообще, любой активно растущий сочный побег (особенно проростки злаковых и бобовых растений) может служить субстратом для питательной среды;

из фитогормонов в свободной продаже можно увидеть гетероауксин и целый калейдоскоп биостимуляторов неизвестного состава, поэтому в качестве фитогормональной составляющей можно использовать воду (молоко) кокосового ореха, вытяжку из эндосперма кокоса или других незрелых плодов;

в качестве сахарозы можно применять обыкновенный свекольный или тростниковый сахар, лучше рафинированый;

агар-агар — желатиноподобное вещество. Агар-агар из водорослей растворяют при подогревании. Агар-агар из сои требует более длительного набухания в холодной воде с последующим подогреванием на водяной бане. Вместо агара можно использовать пищевой желатин или густой крахмальный клейстер.

Составление питательных сред начинают с приготовления растворов солей. Как правило, соли макроэлементов растворяют в небольшом объеме воды, чаще всего в 10 раз меньшим, чем рабочий раствор. В таком виде растворы солей удобнее и хранить, и добавлять в питательные смеси.

В случае использования удобрений требуется произвести расчет содержания необходимого вещества в удобрении и, в соответствии с этим показателем, сделать корректировку веса компонента. Макросоли и удобрения взвешивают, и навески растворяют по отдельности. Хранить такие растворы можно в холодильнике до 1 месяца. При применении растворов макросолей на 1л общего объема питательной среды берут по 100 мл их растворов.

Соли микроэлементов растворяют в 1/1000 от рабочего объема раствора питательной среды и при добавлении их в раствор берут 1 мл на 1 л среды.

Очень ответственно следует отнестись к приготовлению растворов солей железа. Само железо должно перейти в хелатную форму, поэтому навески солей растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 5 мл/л. Раствор должен получиться ярко-желтого цвета, рН 8,0. Хранить такой раствор следует в холодильнике 3 — 4 месяца. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок фосфатов кальция и магния.

Концентрированные растворы витаминов готовят из расчета 1/1000 от конечного объема и добавляют 1 мл на 1 л раствора среды. Растворы витаминов хранят в замороженном виде.

В опытах автора очень неплохо зарекомендовала себя смесь витаминов под коммерческим названием «Ундевит». Одно драже используется для приготовления 10 л питательного раствора, поэтому драже растворяют в 100 мл воды и добавляют 10 мл на 1 л конечного раствора. В комплексе « Ундевит» содержится достаточное количество биологических антиоксидантов — витаминов С и Е, что стимулирует начальную фазу образования каллюсных клеток.

Реальную трудность в приобретении представляют фитогормональные компоненты и мезоинозит. Как уже говорилось выше, мезоинозит, как один из элементов веществ группы биоса может быть получен из дрожжевой культуры. В данном случае после ферментации требуется полностью убить грибные клетки. Это осуществляется кипячением емкости (банки) с культурой дрожжей в водяной бане под давлением. В домашних условиях этот процесс проводят в скороварке. Культура дрожжей подвергается кипячению (автоклавированию) 15 — 30 минут, фильтруется и замораживается.

При необходимости фитогормоны получают из растительного материала. Следует помнить, что некоторые биологически-активные вещества термолабильны, т.е. разрушаются при нагревании, поэтому после измельчения растительного субстрата, экстрагирования и фильтрации через

Рис. 94. Расположение агара в пробирках: 1а. «прямой агар» 16. «косой агар»

2. способ расположения пробирки с расплавленным агаром для приготовления «косого агара». Пробирки закрыты ватными тампонами.

хлопчатобумажную ткань экстракт стерилизуют путем продолжительного (0,5 —1,0 ч) облучения ультрафиолетом.

Подобным образом стерилизуют воду кокосового ореха и экстракт из незрелых плодов конского каштана. При экстрагировании биологически-активных веществ из эндосперма кокоса следует учитывать, что кокосовое масло твердое, поэтому эндосперм измельчают на терке и растирают в ступке с небольшим количеством сахара и воды. Полученную массу перекладывают на хлопчатобумажную ткань и выжимают. К жидкости добавляют равное количество этилового спирта, тщательно перемешивают и отфильтровывают. Фильтрат помещают в холодильник и после застывания на его поверхности масла аккуратно проделывают два диаметрально противоположных отверстия и сливают жидкость в отдельную стеклянную емкость. Для удаления спирта жидкость нагревают в водяной бане. Далее жидкость переливают в емкость из оргстекла или пластиковый пакет и облучают ультрафиолетом.

Так же неплохо себя зарекомендовал в качестве биологически-активной добавки настой биогумуса. Его готовят из расчета 100 г сухого биогумуса на 1 л воды при температуре +55 •— +60 °С, настаивают в течение суток, дважды фильтруют через ткань и через фильтровальную бумагу и облучают ультрафиолетом.

Перед употреблением ингредиенты смешивают, при необходимости корректируют рН до 5,5 — 6,5 , добавляя по каплям НС1 или NaOH .7 — 8 г агара растворяют в 200 мл воды, нагревают в водяной бане и добавляют в смесь при постоянном перемешивании. Объем раствора доводят до 1 л. Естественно, показатель рН несколько повысится, и его повторно корректируют.

Среду разливают в чашки Петри, банки и пробирки. Чашки Петри и банки закрывают крышками. Пробирки закрывают ватными пробками, пробки сверху обертывают целлофаном или пергаментом и затягивают резинкой. Для получения косого агара пробирки располагают наклонно до застывания агара.

В некоторый случаях, когда часть питательной среды остается невостребованной, ее переливают в отдельную емкость, нагревают на водяной бане, не доводя до кипячения, закрывают емкость крышкой или пробкой, охлаждают и хранят в холодильнике при температуре около +4 °С не более одного месяца. При необходимости емкость нагревают в водяной бане и расплавленную питательную среду разливают по сосудам.

Стерилизация исходного материала

Как уже говорилось, культуру каллюсных клеток можно получить практически из любого вегетативного и генеративного органа, но при микроразмножении кактусов используют меристематические ткани, либо первичные, либо вторичные.

В качестве материала для клонирования «меристематической тканью» используют клетки камбия (вторичной меристемы), апекса стебля или меристематические клетки ареол. В случае расположения вегетативной точки в аксилле (например, Mammillaria sp.sp), в субаксиллярном пространстве (например, Dolichothele sp.sp.) или в продольной борозде, соединяющей аксиллу и ареолу (например, Coryphantha sp.sp.), используют ткани из этих зон, т.е. для микроразмножения применяется меристема вегетативных точек.