В ордене св. Иоанна Иерусалимского установились со временем три разряда членов: там были настоящие рыцари, или кавалеры, священники и военнослужащие, так называемые «serventi d'armi». С самого основания ордена требовалось от желающих вступить в число действительных рыцарей доказательство благородного происхождения. Прежде не нужно было представлять подробные родословные, но когда дворяне начали вступать в неравные браки, тогда стали требовать сведения не только об отце и матери, но и двух других восходящих поколениях, которые должны были принадлежать к древнему дворянству и по фамилии, и по гербу. При этом поставлено было, что не могут быть приняты в число рыцарей те, чьи родители были банкирами, хотя бы они и имели дворянские гербы. Такое же правило было постановлено и в отношении тех, чьи родители занимались торговлей вообще или же, присвоив себе какое-либо имущество ордена, не возвратили его по принадлежности. Лица, удовлетворявшие генеалогическим требованиям, получали рыцарское звание по праву рождения «cavalieri di giustizza», но звание рыцаря могло быть в виде милости предоставлено по усмотрению великого магистра и другим, в определённом, впрочем, числе, лицам, которые не подходили под означенные требования. Лица эти, находясь в ордене, назывались «cavalieri di grazzia». Ни в каком, однако, случае не был открыт доступ в рыцарство хотя бы самым отдалённым потомкам еврея, как по мужскому, так равно и по женскому колену. От военнослужащих, то есть от «servienti d'armi», не требовалось доказательств дворянского происхождения, но требовалось только свидетельство о том, что отец и дед вступающего в этот разряд ордена не были рабами и не промышляли каким-либо художеством или ремеслом.

При монашеском устройстве ордена одежду его членов составляла чёрная суконная мантия по образцу одежды св. Иоанна Крестителя, сотканной из верблюжьего волоса, с узкими рукавами, которые должны были напоминать иноку о том, что он лишился свободы. На левом плече мантии был нашит большой крест из белого полотна. Крест этот был осьмиконечный и служил символом восьми блаженств, ожидающих праведника в загробной жизни. Когда же монашеский орден иоаннитов обратился в военное братство, то для рыцарей был введён красный супервест с нашитым на груди так называвшимся мальтийским крестом. Поверх супервеста надевались блестящие латы. Рыцарской одежде придавалось чрезвычайно важное значение: её могли носить только те, которые были посвящены в рыцарский сан, и кроме того, право на эту одежду предоставлялось по орденским статутам независимым государям и тем из знатнейших дворян, которые, при их набожности и других добродетелях, вносили в казну братства единовременно 4000 скудо золотом. Для женщин, принадлежавших к составу ордена, была установлена длинная чёрная одежда с белым осьмиконечным крестом на груди, такого же цвета и с таким же на левом плече крестом, суконная мантия и чёрный остроконечный клобук с чёрным покрывалом.

Великий магистр ордена, избираемый с особенною торжественностью из числа рыцарей, вступивших в орден по праву рождения, считался державным государем; рыцари целовали у него руку, преклоняя перед ним колено. Статут предписывал «умилённо» молиться за него. При богослужении читалась о нём следующая молитва: «помолимся, да Господь Бог наш Иисус Христос просветит и наставит великого нашего магистра (имярек) к управлению странноприимным домом ордена нашего и братии нашей и да сохранит его в благоденствии на многая лета». В числе особенных прав, которые были предоставлены великому магистру, было право позволять рыцарям «пить воду», чего после вечернего колокольного звона никто, кроме него, разрешить не мог.

Орден разделялся на восемь языков или наций. Собрание одного языка составляло великое приорство того же государства и от него получало содержание. Великое приорство делилось на несколько приоратов, которые, в свою очередь, подразделялись на бальяжи, или командорства, состоявшие из недвижимых имений разного рода, и владельцы таких имений, как родовых, так и орденских, носили титул бальи, или командоров. После введения в Англии реформации язык великобританский, как нации уже не католической, считался упразднённым до тех пор, пока Англия присоединится опять к святой церкви.

Великий магистр управлял делами ордена при содействии священного капитула, состоявшего из членов, избранных по два от каждого языка. Капитул собирался в заседание после обедни, причём были носимы перед великим магистром флаг и знамя ордена. Члены капитула перед открытием заседания, целуя руку великого магистра, подавали ему кошельки, на которых было означено имя каждого члена. В кошельках этих находилось по пяти серебряных монет, называвшихся «жанетами». Подача денег великому магистру должна была означать отчуждение рыцарей от их собственности. В эти же кошельки клались записки членов капитула с их мнениями относительно дел, подлежавших обсуждению в заседании капитула.

Одним из правил, введённых при самом основании ордена, было общежитие. Живя все вместе, рыцари составляли «конвент». На практике было сделано, однако, отступление от этого правила, и от рыцаря требовалось только, чтобы он или сряду пять лет, или хоть в разное время, но в общей сложности пробыл в конвенте такое же число лет. Без особого дозволения великого магистра вне его местопребывания, города Ла-Валетты, не мог ночевать ни один рыцарь, живший в конвенте. За общим рыцарским столом положено было отпускать на каждого рыцаря в день, по крайней мере, один фунт мяса, один графин хорошего вина и шесть хлебов. В постные дни мясо заменялось таким же количеством рыбы и яйцами.

Кроме обетов человеколюбия, рыцари давали обет искоренять «магометанское исчадие». Они должны были обучаться военному искусству и совершить по крайней мере пять так называвшихся «караванов». Под «караваном» подразумевалось плавание на галерах ордена с 1 июля по 1 января или с 1 января по 1 июля, так что в общей сложности каждый кандидат в рыцари должен был проплавать в море по крайней мере два с половиною года. Пребывание в караванах считалось искусом. После чего «новициат», удовлетворявший всем условиям, принимался в число рыцарей с соблюдением торжественных обрядов. Он приносил обет послушания, целомудрия и нищеты и давал клятву положить свою жизнь за Иисуса Христа, за знамение животворящего Креста и за своих друзей, то есть за исповедовавших католическую веру. В силу обета целомудрия мальтийский рыцарь не только не мог быть женат, но даже не мог иметь в своём доме родственницы, рабыни или невольницы моложе пятидесяти лет.

Желающего вступить в число рыцарей должен был представить один из имеющих рыцарское звание, и, после удостоверения о благородном происхождении новициата, назначался день его посвящения в число членов ордена.

Поступающий в рыцари приходил до начала обедни в церковь в широкой, неподпоясанной одежде, что должно было означать ту полную свободу, которою он пользовался до вступления в рыцарство. Он становился на колени, а принимающий его в орден давал ему в руку зажжённую свечу и спрашивал его: обещает ли он иметь особое попечение о вдовах, сиротах, беспомощных и о всех бедных и скорбящих? На этот вопрос принимаемый давал утвердительный ответ по установленной форме. После того приниматель вручал ему обнажённый меч, говоря, что меч этот даётся ему на защиту бедных, вдов и сирот и для поражения всех врагов святой католической церкви. Затем приниматель ударял посвящаемого своим обнажённым мечом три раза плашмя по правому плечу, говоря, что хотя такой удар и наносит бесчестие дворянину, но что удар этот должен быть для него последним. После этого посвящаемый поднимался с колен и три раза потрясал своим мечом, угрожая врагам католической церкви. По окончании этого обряда приниматель вручал посвящаемому золотые шпоры, замечая, что они служат для возбуждения горячности в конях, а потому должны напоминать ему о той горячности, с какою он обязан исполнять даваемые им теперь обеты. Что же касается собственно золотых шпор, надеваемых на ноги, которые могут быть и в пыли, и в грязи, то это знаменует презрение рыцаря к сокровищам, корысти и любостяжанию.