К концу XV — началу XVI века движение среди западнорусского населения за воссоединение с Россией ещё больше усилилось. В конце 1499 года князь Вельский просил Ивана III, чтобы он «пожаловал… и с вотчиною взял на службу». Вельский жаловался, что в Литве на русских людей «пришла великая нужа о греческом законе». За этим последовали обращения и переходы многих других верховских и чернигово-северских князей. Весной 1500 г. это движение приняло уже открытый характер. Города Чернигов, Стародуб, Путивль, Новгород-Северский с их землями перешли к России.

Следует отметить, что стремление к воссоединению теперь находило мощную поддержку и со стороны Российского государства. Это диктовалась государственными интересами, но основой было сознание единства происхождения, которое жило в массах русского народа.

Уже в 80-х годах XV века русское правительство стремится создать антиягеллоновскую коалицию, чтобы добиться возвращения всех древнерусских земель, отнятых Литвой и Польшей. Даже неудача с союзом против Ягеллонов не задержала перехода России к активной политике в этом направлении. В 1492 г. Великий Князь Московский Иван III (Рюрикович) требует от литовского великого князя: «…и ты бы наших городов и волостей наших земель и вод, которые держиш за собою, нам поступился».

В 1500 г. началась война между Литвой и Россией. В короткий срок с помощью местного населения русские войска заняли обширные территории. При полном содействии малороссов был освобождён весь бассейн реки Десны. Победы русских войск на реке Ведрошь, а затем под Мстиславлем закрепляли переход этих земель к России.

Литва вынуждена была в 1503 году просить перемирия. По этому перемирию древнерусские города и земли назывались уже не «отчиной» (собственностью), а только «землями» Литвы. За Россией были оставлены, обширные княжества: Чернигово-Стародубское и Новгород-Северское, а также город Любеч на Днепре и город Путивль на речке Сейм. В этой части России границы её подходили к Днепру. Киев отстоял теперь в 40–50 км от русской границы, что имело важное стратегическое значение. Так в начале XVI века Российское государство сделало первую попытку начать воссоединение русского этноса.

И после этого русское правительство продолжало напоминать Литве и Польше о возвращении всех захваченных ими древнерусских земель. Все эти земли объявлялись «отчиной» Руси на основании как этнической принадлежности их населения, так и их прошлого. «Не то одно наша отчина, коя городы и волости ныне за нами: и вся Русская земля, Киев и Смоленск и иные городы, которые он за собою держит к Литовской земле… из старины… наша отчина». «Каждому отчизна своя мила и каждому своего жаль», — объясняли русские дипломаты литовским правителям.

В 1507 г. возобновилась война с Литвой. Население в Белоруссии и на Киевщине под руководством бояр Глинских (1508 г.) восстало против господства Литвы за переход этих земель в состав России. По миру 1508 г. Чернигово-Северская земля осталась за Россией.

Не забывают в России и Галицию. В 1563 году послам короля Сигизмунда II Августа было предъявлено требование возвратить России все русские земли. Русское правительство составило полный список городов, которые оно требовало возвратить, в том числе и галицийские — Перемышль, Львов и Галич. Этот вопрос русское правительство считало для себя настолько важным, что в ходе переговоров в течение нескольких месяцев не снимало его с обсуждения.

Обосновывая свои права на эти города, правительство объясняло, как они были отторгнуты: «… а те городы, — заявляли русские дипломаты, — искони русских государей… а зашла та вотчина за государя вашего… некоторыми незгодами после Батыева пленения, как безбожный Батый многие грады русские попленил, и после того потому от государей наших… те городы поотошли».

Переселения малороссов в Северо-восточную Русь, которые начались в XIV веке, не прекращались и в XVI веке. Однако теперь в этом движении появился ряд новых черт. Если в XIV–XV веках переходили феодалы, присоединяя свои земли к Московскому княжеству или поступая на службу со своими людьми, и переселялись одиночки — беглые крестьяне и горожане, то в XVI веке наблюдаются уже массовые переселения в пределы Российского государства малороссов, в первую очередь, казаков.

Вместе с выходцами из великорусских земель казаки собирались в «диком поле» пограничья, предлагая правительству свои услуги в качестве служилых людей, заявляя о своей готовности нести пограничную службу, защищать рубежи Российского государства. Так, в 1589 г. на речку Северский Донец переселилось около 700 казаков. Здесь следует отметить, что приём казаков на пограничную службу впервые введён был в Российском государстве задолго до создания реестрового казачества польским правительством.

После Люблинской унии в 1569, когда Малороссия стала юридически подчинённой Польше, на южнорусских землях началась политика ополячивания русских. В 1596 г. на специально созванном польским королём Сигизмундом III церковном соборе в Бресте была официально объявлена церковная уния, вошедшая в историю под названием Брестской. Уния провозглашала подчинение православной церкви католической и признание папы римского главой униатов. Православная церковь объявлялась еретической. Против православного духовенства стали применять репрессии. Брестская уния должна была окончательно разорвать и церковные связи Западной Руси с Россией.

В борьбе с католицизмом и ополячиванием в это время в Малороссии возникла значительная полемическая литература, в издании которой большую роль сыграли братства: организации оппозиционно настроенных к Польше горожан. С особой остротой и горячностью обличал ренегатов афонский монах-публицист, уроженец Львова Иван Вишенский. В ряде своих произведений («Послание до епископов» и др.) Вишенский выступает за свободу «Руси», «Малой России», «народа русского», за «народу русского вольности».

О двух частях «народа росского» — «Великой России», которая «и до селе квитнет» (цветёт), и о «Малой России», составляющих единое целое, говорится, например, в произведении Архимандрита Киево-Печерской Лавры Захарии Копистенского «Палинодия или Книга Обороны святой апостолской Всходней церкви» (1619–1622 гг.). В ней архимандрит с гордостью рассказывает об успехах Российского государства как о «сильном муре (стене) медяном», о Москве, где «суть люде мудрий».

Но не только словом боролись малороссы с дерусификацией своей земли. В конце 1591 г. в Малорссии началось движение под руководством старшего реестровых казаков Криштофа Косинского. С запорожскими казаками, а также с крестьянами и мещанами Косинский напал на город Белая Церковь и разгромил владения волынского воеводы князя Януша Острожского и его помощника, князя Дмитрия Курцевича-Булыги.

Некоторое время спустя Косинский установил связи с русским правительством царя Фёдора Ивановича. Криштоф Косинский и восставшие просили царя принять их в подданство. За это Косинский безоговорочно передавал России территорию, которую восставшие очистили к тому времени от поляков. Поскольку переход освобождённых земель в состав России был крайне выгоден Москве, русское правительство быстро ответило согласием на обращение казацкого вождя.

Отвечая Косинскому и запорожцам, Царь Федор впервые назвал себя государем, в том числе, и южнорусских земель. Российское государство признавало Запорожье и всё Поднепровье своим владением, а запорожцев принимало к себе на службу и назначало им жалованье. Князь Александр Вишневецкий, сообщая об этом польскому канцлеру Замойскому, в своём письме 13 мая 1593 г. писал: «На этом он (Косинский. — прим А. И.) принёс присягу и великому князю московскому со всем своим войском и передал уже всё пограничье больше чем на 100 миль на тех границах. В своей грамоте к ним великий князь уже именовал себя царём запорожским, черкасским и низовским и послал на Запорожье сукно и деньги».