В Москве она устроила госпиталь для раненых, создала специальные комитеты по обеспечению вдов и сирот погибших на фронте. Но русские войска терпели одно поражение за другим. Война показала техническую и военную неподготовленность России, недостатки государственного управления. Началось сведение счетов за былые обиды произвола или несправедливости, небывалый размах террористических актов, митинги, забастовки. Государственный и общественный порядок разваливался, надвигалась революция.

Сергей Александрович считал, что необходимо принять более жесткие меры по отношению к революционерам и доложил об этом императору, сказав, что при сложившейся ситуации не может больше занимать должность генерал-губернатора Москвы. Ему трудно было найти общий язык с революционерами того времени, он в отличие от других меценатов не финансировал всякие террористические организации, особенно социалистического толка и всех, кто звал Русь к топору. Поэтому его ненавидели будущие ленинцы и нечаевцы. Государь принял отставку, и супруги покинули губернаторский дом, переехав временно в Нескучное.

Тем временем боевая организация эсеров приговорила великого князя Сергея Александровича к смерти. Ее агенты следили за ним, выжидая удобного случая, чтобы совершить казнь. Елизавета Федоровна знала, что супругу угрожает смертельная опасность. В анонимных письмах ее предупреждали, чтобы она не сопровождала своего мужа, если не хочет разделить его участь. Великая княгиня тем более старалась не оставлять его одного и, по возможности, повсюду сопровождала супруга.

5 февраля 1905 года Сергей Александрович был убит бомбой, брошенной террористом Иваном Каляевым. Когда Елизавета Федоровна прибыла к месту взрыва, там уже собралась толпа. Кто-то попытался помешать ей подойти к останкам супруга, но она своими руками собрала на носилки, разбросанные взрывом куски тела мужа.

На третий день после смерти мужа Елизавета Федоровна поехала в тюрьму, где содержался убийца. Каляев сказал: «Я не хотел убивать вас, я видел его несколько раз и то время, когда имел бомбу наготове, но вы были с ним, и я не решился его тронуть».

− И вы не сообразили того, что вы убили меня вместе с ним? − ответила она. − Я принесла прощение от Сергея Александровича, покайтесь!

− Никогда, − ответил террорист. − Если бы меня десять раз казнили, и то я бы не отказался.

Все же Елизавета Федоровна оставила в камере Евангелие и маленькую иконку, надеясь на чудо. Выходя из тюрьмы, она сказала:

− Моя попытка оказалась безрезультатной, хотя, кто знает, возможно, что в последнюю минуту он осознает свой грех и раскается в нем.

Великая княгиня просила императора Николая II о помиловании Каляева, но это прошение было отклонено.

С момента кончины супруга Елизавета Федоровна не снимала траур, стала держать строгий пост, много молилась. Ее спальня в Николаевском дворце стала напоминать монашескую келью. Вся роскошная мебель была вынесена, стены перекрашены в белый цвет, на них находились только иконы и картины духовного содержания. На светских приемах она не появлялась. Бывала только в храме на бракосочетаниях или крестинах родственников и друзей и сразу уходила домой или по делам. Теперь ее ничто не связывало со светской жизнью.

Она собрала все свои драгоценности, часть отдала казне, часть — родственникам, а остальное решила употребить на постройку обители милосердия. На Большой Ордынке в Москве Елизавета Федоровна приобрела усадьбу с четырьмя домами и садом. В самом большом двухэтажном доме расположились столовая для сестер, кухня и другие хозяйственные помещения, во втором — церковь и больница, рядом — аптека и амбулатория для приходящих больных. В четвертом доме находилась квартира для священника-духовника обители, классы школы для девочек приюта и библиотека.

10 февраля 1909 года Великая княгиня собрала 17 сестер основанной ею обители, сняла траурное платье, облачилась в монашеское одеяние и сказала: «Я оставлю блестящий мир, где я занимала блестящее положение, но вместе со всеми вами я восхожу в более великий мир — в мир бедных и страдающих».

День в Марфо-Мариинской обители начинался в 6 часов утра. После общего утреннего молитвенного правила. В больничном храме Великая княгиня давала послушания сестрам на предстоящий день. Свободные от послушания оставались в храме, где начиналась Божественная Литургия. Дневная трапеза проходила с чтением «Жития Святых». В 5 часов вечера в церкви служили вечерню с утреней, где присутствовали все свободные от послушания сестры. Под праздники и воскресение совершалось всенощное бдение. В 9 часов вечера в больничном храме читалось вечернее правило, после него все сестры, получив благословение настоятельницы, расходились по кельям. Четыре раза в неделю за вечерней читались акафисты: в воскресенье — Спасителю, в понедельник — архангелу Михаилу и всем Бесплотным Небесным Силам, в среду — святым женам-мироносицам Марфе и Марии и в пятницу — Божьей Матери или Страстям Христовым. В часовне, сооруженной в конце сада, читался Псалтирь по покойникам. Часто ночами молилась там сама настоятельница. Внутренней жизнью сестер руководил замечательный священник и пастырь — духовник обители, протоирей Митрофан Серебрянский. Дважды в неделю он проводил беседы с сестрами. Кроме того, сестры могли ежедневно в определенные часы приходить за советом и наставлением к духовнику или к настоятельнице. Великая княгиня вместе с отцом Митрофаном учила сестер не только медицинским знаниям, но и духовному наставлению опустившихся, заблудших и отчаявшихся людей. Каждое воскресенье после вечерней службы в соборе Покрова Божьей Матери устраивались беседы для народа с общим пением молитв.

Богослужение в обители всегда было великолепным благодаря пастырским достоинствам духовников, приглашаемых настоятельницей. Сюда приходили для совершения богослужений и проповедования лучшие пастыри и проповедники не только Москвы, но и многих отдаленных уголков России. Как пчела собирает нектар со всех цветов, чтобы люди ощутили особый аромат духовности, так и настоятельница собирала лучших пастырей. Обитель, ее храмы и богослужение, вызывали восхищение современников. Этому способствовали не только храмы обители, но и прекрасный парк с оранжереями — в лучших традициях садового искусства XVIII–XIX веков. Это был единый ансамбль, соединявший гармонично внешнюю и внутреннюю красоту.

Великая княгиня совсем не имела высокого мнения о своих качествах… У нее никогда не было слов «не могу», и никогда ничего не было унылого в жизни Марфо-Мариинской обители. Все было там совершенно как внутри, так и снаружи. И кто бывал там, уносил прекрасное чувство».

В Марфо-Мариинской обители Великая княгиня вела жизнь подвижницы. Спала на деревянной кровати без матраца. Строго соблюдала посты, вкушая только растительную пищу. Утром вставала на молитву, после чего распределяла послушания сестрам, работала в клинике, принимала посетителей, разбирала прошения и письма.

Вечером, — обход больных, заканчивающийся за полночь. Ночью она молилась в молельне или в церкви, ее сон редко продолжался более трех часов. Когда больной метался и нуждался в помощи, она просиживала у его постели до рассвета. В больнице Елизавета Федоровна брала на себя самую ответственную работу: ассистировала при операциях, делала перевязки, находила слова утешения, стремилась облегчить страдания больных. Они говорили, что от Великой княгини исходила целебная сила, которая помогала им переносить боль и соглашаться на тяжелые операции.

В качестве главного средства от недугов настоятельница всегда предлагала исповедь и причастие. Она говорила: «Безнравственно утешать умирающих ложной надеждой на выздоровление, лучше помочь им по-христиански перейти в вечность».

Сестры обители проходили курс обучения медицинским знаниям. Главной их задачей было посещение больных, бедных, брошенных детей, оказание им медицинской, материальной и моральной помощи.

В больнице обители работали лучшие специалисты Москвы, все операции проводились бесплатно. Здесь исцелялись те, от кого отказывались врачи.