Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М. зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами (см. Люминесценция ). При этом методе в оптическую схему М. вводятся два светофильтра . Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.
Метод широко применяется в микробиологии , вирусологии , гистологии , цитологии , в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе , в дефектоскопии . Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.
Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность М., т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны l применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей l = 400—250 нм, тогда как для видимого света l = 700—400 нм ). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания , пиримидиновые основания, большинство витаминов , ароматические аминокислоты , некоторые липиды , тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.
Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.
Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электроннооптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.
Микрофотографирование и микрокиносъёмка, т. е. получение с помощью М. изображений на светочувствительных слоях, широко применяется в сочетании со всеми другими методами микроскопического исследования. Оптическая система М. при микрофото- и микрокиносъёмке требует некоторой перестройки — иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом (подробнее об этом см. в ст. Микропроекция ). Многие современные М. имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, которые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов на фотопластинку или плёнку (а большинство М. может быть с этой целью оснащено дополнительными принадлежностями). Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъёмка важна при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших химических реакций и т. п.).
Основные узлы микроскопа. В большинстве типов М. (за исключением инвертированных, см. ниже) над предметным столиком, на котором закрепляют препарат, располагается устройство для крепления объективов, а под столиком устанавливается конденсор. Любой М. имеет тубус (трубку), в котором устанавливаются окуляры; обязательной принадлежностью М. являются также механизмы для грубой и точной фокусировки (осуществляемой путём изменения относительного положения препарата, объектива и окуляра). Все эти узлы крепятся на штативе или корпусе М.
Тип применяемого конденсора зависит от выбора метода наблюдения. Светлопольные конденсоры и конденсоры для наблюдения по методу фазового или интерференционного контраста представляют собой сильно отличающиеся одна от другой двух- или трёхлинзовые системы. У светлопольных конденсоров числовая апертура может достигать 1,4; в их состав входит апертурная ирисовая диафрагма , которая иногда может смещаться в сторону для получения косого освещения препарата. Фазово-контрастные конденсоры снабжены кольцевыми диафрагмами. Сложными системами из линз и зеркал являются темнопольные конденсоры. Отдельную группу составляют эпиконденсоры — необходимые при наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете системы кольцеобразных линз и зеркал, устанавливаемых вокруг объектива. В УФ микроскопии применяются специальные зеркально-линзовые и линзовые конденсоры, прозрачные для ультрафиолетовых лучей.
Объективы в большинстве современных М. сменные и выбираются в зависимости от конкретных условий наблюдения. Часто несколько объективов закрепляются в одной вращающейся (т. н. револьверной) головке; смена объектива в этом случае осуществляется простым поворотом головки. По степени исправления хроматической аберрации различают микрообъективы ахроматы и апохроматы . Первые наиболее просты по устройству; хроматическая аберрация в них исправлена только для двух длин волн, и изображение при освещении объекта белым светом остаётся слегка окрашенным. В апохроматах эта аберрация исправлена для трёх длин волн, и они дают бесцветные изображения. Плоскость изображения у ахроматов и апохроматов несколько искривлена (см. Кривизна поля ). Аккомодация глаза и возможность просмотра всего поля зрения с помощью перефокусировки М. отчасти компенсируют этот недостаток при визуальном наблюдении, однако он сильно сказывается при микрофотографировании — крайние участки изображения получаются нерезкими. Поэтому широко используют микрообъективы с дополнительным исправлением кривизны поля — планахроматы и планапохроматы. В сочетании с обычными объективами применяют специальные проекционные системы — гомали, вставляемые вместо окуляров и исправляющие кривизну поверхности изображения (для визуального наблюдения они непригодны).
Кроме того, микрообъективы различаются: а) по спектральным характеристикам — на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые или зеркально-линзовые); б) по длине тубуса, на которую они рассчитаны (в зависимости от конструкции М.), — на объективы для тубуса 160 мм, для тубуса 190 мм и для т. н. «длины тубуса бесконечность» (последние создают изображение «на бесконечности» и применяются совместно с дополнительной — т. н. тубусной — линзой, переводящей изображение в фокальную плоскость окуляра); в) по среде между объективом и препаратом — на сухие и иммерсионные; г) по методу наблюдения — на обычные, фазово-контрастные, интерференционные и др.; д) по типу препаратов — для препаратов с покровным стеклом и без него. Отдельный тип представляют собой эпиобъективы (сочетание обычного объектива с эпиконденсором). Многообразие объективов обусловлено разнообразием методов микроскопических наблюдений и конструкций М., а также различиями в требованиях к исправлению аберраций в разных условиях работы. Поэтому каждый объектив можно применять только в тех условиях, для которых он рассчитан. Например, объективом, рассчитанным для тубуса 160 мм, нельзя пользоваться в М. с длиной тубуса 190 мм; с объективом для препаратов с покровным стеклом нельзя наблюдать препараты без покровного стекла. Особенно важно соблюдать расчётные условия при работе с сухими объективами больших апертур (А > 0,6), которые очень чувствительны ко всяким отклонениям от нормы. Толщина покровных стекол при работе с этими объективами должна быть равна 0,17 мм. Иммерсионный объектив можно использовать только с той иммерсией, для которой он рассчитан.
