Те же «игры» могут разыгрываться для белков, использующих другие избыточные кодоны, для других аминокислот.

Для завершения рабочей гипотезы (и ответа на 3-й вопрос) остается предположить, что «зрелость», дееспособность любой тРНК определяется полнотой ее «миноризации», полнотой набора «положенных ей» миноров. Мы знаем, что первоначально тРНК синтезируется как цепочка нормальных нуклеотидов. Миноризация происходит потом, в цитоплазме, благодаря активности метилаз и других модифицирующих ферментов. Это означает, что управление скоростями биосинтеза ферментов и прочих белков переносится на уровень соотношения активностей различных метилаз и других модификаторов. (Число их должно отвечать числу разных тРНК и необходимому количеству модификаций в каждой из них.) Но активизация или угнетение активности различных ферментов может зависеть от веществ, поступающих в клетку извне, из крови. Например, необходимых низкомолекулярных «помощников» ферментов. Иногда эту роль играют ионы определенных металлов или простые молекулы некоторых витаминов.

Подтверждение этой гипотезы открыло бы колоссальные новые перспективы для медицины, поскольку многие заболевания связаны с нарушениями пропорций биосинтеза белков в клетках, определяющих функционирование важных для жизнеспособности органов. А иногда причиной болезни может служить отсутствие синтеза некоего белка или наоборот — синтез белка вредного. Гипотеза дает надежду на возможность управления всеми этими отклонениями от нормы извне, через кровь или лимфу. Притом не чисто эмпирически, а сознательно: воздействуя на активность модифицирующих тРНК ферментов. (Разумеется, для этого они должны быть выделены и изучены.)

Но каким образом полнота «миноризации» молекулы тРНК может влиять на ее дееспособность? Ответ, по-видимому, надо искать в механизме взаимодействия несущей аминокислоту тРНК с рибосомой. Уже упоминалось, что молекулы тРНК складываются и приобретают некую пространственную конфигурацию. В ее образовании должны играть свою роль миноры. Сама же эта конфигурация может быть необходима для того, чтобы занять нужную позицию на рибосоме. Из этого предположения неявно вытекает еще и возможность того, что сама рибосома «дышит» — слегка меняет конфигурацию «места узнавания» в зависимости от приходящего в него кодона. Недаром же рибосома представляет столь сложное образование (в нее входит несколько десятков белков и специальные «рибосомные РНК»).

Вот такова гипотеза. Но как приступить к поиску ее подтверждения?

В первую очередь надо было найти объект исследования, который можно изучать в двух физиологически различных состояниях с тем, чтобы сравнить наборы изоакцепторных тРНК в каждом из них. Затем можно было бы провести реакцию синтеза белков in vitro, совмещая в ней информационную РНК и ферментную систему из одного состояния с набором всех тРНК из другого состояния. Проанализировать весь спектр белков, синтезируемых в такой гетерогенной системе, и сравнить его с наборами белков, синтезируемых в гомогенных системах, когда информационные РНК, ферменты и тРНК были бы взяты из одного и того же состояния. Быть может, таким образом удалось бы показать, что набор синтезируемых белков действительно определяется набором дееспособных тРНК.

К счастью, такой во всех отношениях удобной объект уже существовал и физиологически был хорошо изучен. Его за несколько лет до того отыскал заведующий одной из лабораторий Института биологии развития, молодой, но очень талантливый исследователь Саша Нейфах. Я был с ним хорошо знаком.

Этим объектом служила маленькая рыбка вьюн, похожая на очень короткого (не более 30 см в длину) угря. Вьюны водятся в нашей средней полосе, особенно в старицах рек и в других неглубоких и стоячих водоемах. Их Саше пару раз в месяц привозил в двух больших бидонах (самцы и самки отдельно) очень колоритный, высокий и жилистый старик. Он знал. наверное, все места в центральной России, где водится вьюн. Держал их в секрете. Теперь и я стал его клиентом. В оплату за труды старика зачислили в Институт лаборантом. Вьюны предпочитают температуру не выше 20°С. Я их хранил в нескольких больших пластмассовых баках для белья, штук по 50 в каждом, в «холодной комнате» при +4°С. Там они благополучно дремали до очередного опыта. Кормить их не было нужды — только ежедневно менять воду. Отработанная Нейфахом процедура получения оплодотворенной икры была достаточно простой. Самкам вкалывали половой гормон хориогонин и через 39 часов пребывания при температуре +17°С легко выдавливали из них икру в плоскую и неглубокую стеклянную чашку с небольшим количеством воды. Заблаговременно, вспоров брюшко у самцов, извлекали семенники, нарезали их на мелкие кусочки, которые раздавливали в ступке с несколькими миллилитрами слабого солевого раствора. В чашку с икрой через смоченную водой марлю выдавливали экстракт из семенников. При осторожном перемешивании происходило оплодотворение — икра явно набухала... Далее Саша следил за ранним развитием зародышей в тех же чашках, помещая их в термостат при температуре 21,5°С. Время от времени чашки покачивали для улучшения аэрации. Уже через 2 часа в бинокулярную лупу можно было видеть, как на поверхности икринки появлялся первый «пузырек». Затем он делился надвое, потом еще деление и так далее. На икринке нарастает «шапочка» (бластодерма). Это уже зародыш. В течение первых 20 часов он проходит ранние стадии развития (морула — бластула — гаструла). На глаз это заметно как увеличение бластодермы и уменьшение размеров образующих ее клеток. Считается, что через 20 часов в зародыше начинаются процессы «органогенеза». Я не пытался вникнуть в тонкости физиологической эволюции зародыша. Мне было достаточно уверенности в том, что по мере его развития в клетках бластодермы начинают синтезироваться новые, характерные для каждой последующей стадии белки. Эту уверенность разделял и Нейфих. Открывалась возможность обнаруживать изменения белкового состава и наборов тРНК в зародышах с разных стадий развития.

Не устраивали меня только масштабы работы Нейфаха. Ему для наблюдений достаточно было располагать икрой из трех-четырех рыб. А мне для осуществления последующих операций фракционирования белков и тРНК надо было запускать в процесс одновременного развития икру из, по меньшей мере, полусотни рыб. Выращивание зародышей на чашках для этого не годилось. Из нижней половины разрезанной стеклодувом 20-литровой бутылки от реактивов, настольного малогабаритного вентилятора, жидкостного термостата и некоторых вспомогательных устройств мне удалось соорудить прибор, в котором благодаря непрерывной циркуляции 10 литров взвеси икринок в воде происходило нормальное развитие зародышей. (Как ни странно, повторить эту конструкцию не удалось никому, даже Нейфаху — у них икра не росла.)

Не буду описывать процедуры отделения и очистки бластодерм любой стадии развития от «желтка» — самой икринки с ее запасом питательных веществ. Все эти процедуры были отработаны Нейфахом. Важно то, что в результате удавалось получить (в зависимости от стадии развития) от 2 до 5 грамм зародышевого материала. Этого было достаточно для проведения всех многочисленных и тонких операций по вскрытию клеток зародыша, извлечению из них нужных фракций, постановке опытов in vitro и последующего анализа результатов этих опытов.

Ограничусь замечанием, что отработка всех методик и проведение самих экспериментов потребовали от меня и моих двух лаборанток напряженной работы в течение девяти лет. После чего постараюсь вкратце изложить полученные результаты, разбив всю работу на три этапа.

1-й этап. Обследование метилаз вьюна

Поскольку методика сопоставления активностей метилаз из разных источников была уже отработана, решено было провести сравнительную оценку активностей метилаз из разных органов вьюна и его зародышей на 10-часовой и 30-часовой стадиях развития. Соотношения этих активностей оказались бы полезными на заключительной стадии исследования роли тРНК в регулировании биосинтеза белков.