Постоянное вмешательство германских держав во внутреннюю политику триединого государства и угрозы оккупировать Гольштейн неоднократно создавали угрозу новой войны. Общественное мнение Дании также склонялось к военному решению проблемы создания государства до Эйдера, поскольку в стране еще не спала эйфория от победы.
В датском правительстве излишне оптимистично рассчитывали на поддержку в конфликте с Германией со стороны Наполеона III и на благожелательную позицию Великобритании. Однако политическое положение в Европе в это время изменялось не в пользу Дании. Поэтому, когда в ноябре 1863 г. датский парламент принял общую для Дании и Шлезвига конституцию, оппоненты этого решения в самой Дании говорили о нарушении юридических основ датской монархии, которые нейтральные державы считали необходимым соблюдать для поддержания европейского равновесия. Разрыв соглашений 1851–1852 гг. мог привести к войне, завоеванию Гольштейна и оккупации Пруссией датских портов. Согласно новой конституции вводился двухпалатный парламент — ригсрод, в котором за депутатами от Дании обеспечивалось большинство. Конституция должна была вступить в силу с 1864 г. после подписания ее королем. Этот документ был явным вызовом германским государствам.
Вступивший на датский престол Кристиан IX Глюксбург, несмотря на просьбы Франции и России отложить подписание новой конституции Дании и Шлезвига, 18 ноября под давлением своего правительства и общественного мнения все же подписал новый текст основного закона. В ответ Бисмарк заявил, что эта конституция является нарушением соглашений 1851–1852 гг., но, предпочитая прямо присоединить герцогства к Пруссии, он нуждался в поддержке своих планов со стороны других ведущих держав. С целью получить такую поддержку Пруссия одобрила предложение Наполеона III от 5 ноября 1863 г. о созыве конгресса для урегулирования судьбы Польши и замены Венской системы новыми соглашениями. С той же целью Бисмарк поддержал и Россию в ходе польского восстания 1863–1864 гг.
Пруссия и Австрия выставили условием признания Кристиана IX отмену ноябрьской конституции, франкфуртское Союзное собрание 7 декабря 1863 г. постановило оккупировать Гольштейн. Франция, Англия и Россия также поддержали требование отмены новой конституции через совместный демарш своих чрезвычайных посланников в Копенгагене.
Во время правительственного кризиса в Дании произошла оккупация Гольштейна немецкими войсками, а 30 декабря герцог Августенбургский вступил в Киль. Эти события заставили Великобританию 31 декабря 1863 г. предложить собрать мирную конференцию. Бисмарк, зная об изоляции Англии и о том, что ее не поддерживают Франция и Россия, предварительно потребовал отмены конституции. 16 января 1864 г. Пруссия и Австрия направили датскому правительству ультиматум, который был им отклонен, а 1 февраля 1864 г. австрийские и прусские войска в 60 тыс. человек заняли Шлезвиг. Началась новая война между Данией и германскими государствами, к которой сама Дания была слабо подготовлена. В Копенгагене возлагали большие надежды на укрепленную линию Даневирке, но ее оборона силами малочисленного датского войска в зимних условиях оказалась невыполнимой задачей. К марту 1864 г. сорокатысячная датская армия отступила через Фленсбург на укрепленные позиции у г. Дюбель, тогда как другая часть датской армии отошла на север Ютландии в крепость Фредерисия. 18 апреля 1864 г. прусско-австрийские войска разгромили датчан у Дюбеля, где последние продержались около 10 недель, понеся значительные потери. 29 апреля датские войска вынуждены были оставить Фредерисию и эвакуироваться на острова Альс и Фюн.
Перспективы военной помощи Дании со стороны Англии и Франции были минимальными. В этих условиях России удалось добиться созыва в Лондоне весной 1864 г. конференции для разрешения конфликта. 25 апреля 1864 г. в Лондоне при участии Великобритании, Франции и России начались мирные переговоры между представительствами воюющих государств. После ряда военных успехов цель Пруссии была сформулирована открыто — присоединение герцогств. Бисмарку удалось заставить конференцию принять решение разделить Шлезвиг. Датское правительство отказалось рассматривать всякую границу, исключающую с ее территории г. Фленсбург и смешанную территорию, настаивая на линии Шлей-Даневирке. Посредничество Англии и Франции ни к чему не привело, идея плебисцита в смешанных районах после отвода австро-прусских войск также не была принята датчанами. Неудачный исход лондонской конференции означал для Дании потерю Шлезвига. Конференция также выявила и гибельный для Дании антагонизм между Англией и Францией, ставший прологом к неизбежной гегемонии Германии.
25 июня военные действия между Данией и германскими государствами возобновились. Немцам удалось взять о. Альс, австрийский флот подошел к датским водам, Ютландия уже была занята вплоть до Скагена. Расчет на помощь Великобритании или Франции оказался нереалистичным. В этих условиях новое датское правительство немедленно начало переговоры с Пруссией и Австрией, которые привели к Венскому договору 30 октября 1864 г. Король Дании оставлял прусскому королю и австрийскому императору Гольштейн, Лауэнбург и Шлезвиг.
14 августа 1865 г. в Гаштейне Австрия и Пруссия подписали конвенцию с целью урегулирования вопроса о герцогствах Шлезвиг и Гольштейн, по которой право собственности на всю территорию обоих герцогств принадлежало Австрии и Пруссии, но управление ими объявлялось раздельным. В Гольштейне создавалась австрийская администрация, а в Шлезвиге — прусская.
Разрешив шлезвиг-гольштейнскую проблему, Бисмарк пошел на следующий шаг по пути объединения Германии «железом и кровью» — вытеснение Австрии из Германии. Новый экспансионистский шаг был подготовлен дипломатически. Бисмарку удалось заручиться нейтралитетом Наполеона III, пообещав не препятствовать присоединению к Франции части Бельгии и даже левого берега Рейна. В апреле 1866 г. Бисмарк заключил тайное соглашение с Италией, пообещав ей не мешать присоединению Венеции. После этого прусский канцлер прямо перешел в наступление. Он предложил Вене обсудить вопросы реформирования Германского союза, созданного решениями Венского конгресса, и пересмотреть статус Гольштейна, куда в июне 1866 г. были введены прусские войска. Постановка этих провокационных для Австрии вопросов вызвало войну. Бундестаг Германского союза по предложению Австрии решил начать мобилизацию. В ответ на это 16 июня прусские войска вступили в Саксонию, Ганновер, Гессен-Кассель и перешли австрийскую границу. На стороне Австрии выступили Бавария и некоторые другие южногерманские государства, но их военные силы были незначительны. Положение Австрии резко ухудшилось из-за того, что с юга на нее напала Италия, что заставило австрийцев вести войну на два фронта. В военных действиях против итальянских войск австрийцам сопутствовала удача, они разбили итальянцев в сражении под Кустоццей. Успешными были действия австрийского военно-морского флота на Адриатике. Однако на основном театре военных действий австрийские войска были вынуждены отступать. Неожиданно для всей Европы кампания здесь была решена почти за месяц. 3 июля 1866 г. под деревней Садова (в Чехии) пруссаки нанесли австрийской армии решающее поражение. Прусская армия вторглась на территорию собственно Австрии, неудача постигла и войска союзников. Был открыт путь на Вену. Однако трезвомыслящий Бисмарк, опасаясь, что продолжение войны приведет к вмешательству Франции, а это может сорвать планы объединения Германии под эгидой Пруссии, настоял на немедленном заключении мира.
26 июля между Австрией и Пруссией был подписан Никольсбургский прелиминарный мирный договор, территория Австрийской империи, за исключением Венеции, которая передавалась Италии, оставалась нетронутой. Более того, Пруссия обязалась после заключения окончательного мира вывести войска из австрийских владений. Австрия признала «новую организацию Германии без участия Австрийской империи» и согласилась на создание союза германских государств к северу от р. Майн. Территория Саксонского королевства оставалась неизменной, а его будущее положение в Северогерманском союзе подлежало определению в отдельном мирном договоре.
