Следующим важным открытием стало то, что система CRISPR/Cas9 уже известной нам бактерии Streptococcus thermophilus может эффективно работать в кишечной палочке Escherichia coli, то есть система универсальна и не видоспецифична на уровне микроорганизмов. Сообщение об этом открытии опубликовали в 2011 году коллеги из Вильнюсского института биотехнологий, который когда-то тоже входил в состав Главмикробиопрома СССР и занимался получением и очисткой различных ферментов для промышленности и научной работы.
Будущие нобелевские лауреаты 2020 года Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна включились в изучение системы CRISPR в начале двухтысячных. Обе исследовательницы были специалистами по РНК и решили объединить свои усилия, чтобы экспериментально продемонстрировать молекулярные механизмы иммунитета бактерий на основе системы CRISPR/Cas9.
БОЛЬШАЯ РАЗНИЦА
Принципы распознавания чужеродных молекул, используемые иммунитетом многоклеточных (например, человека) и одноклеточных организмов (бактерий), совершенно различны. У людей главную роль в распознавании играют сложные белковые молекулы — антитела, а распознать они должны очень маленький, но значимый фрагмент того или иного белка — антиген. Он короткий, содержит порядка семи аминокислот и свернут в сложную трехмерную структуру. Антитело распознает не линейную последовательность и не отдельные аминокислоты, а антиген в целом, то есть и буквы, и то, в какую трехмерную структуру оказалась свернута эта линейная молекула.
А у бактерий система адаптивного иммунитета распознает не форму, а линейную структуру генетического текста. Есть последовательность вирусной ДНК, закодированная четырьмя нуклеотидами А, Г, Ц и Т, и есть направляющая РНК бактерии, которая должна просто распознать такую же последовательность в полтора десятка нуклеотидов, без всяких там форм, структур и сложного внешнего вида.
Коллеги из Вильнюса тоже продолжали работать в этом направлении и шестого апреля 2012 года отправили в авторитетнейший журнал Cell свою статью о роли CRISPR/Cas9 в иммунном ответе бактерий. Надо сказать, что процесс публикации научных данных в сегодняшней конкурентной среде очень сильно зависит от ненаучных обстоятельств. К сожалению, через шесть дней в публикации статьи было отказано даже без проведения внешней рецензии. Редактор журнала сразу написал авторам, что статья не представляет никакого научного интереса, и даже не обратился к своим коллегам-ученым с просьбой провести экспертизу представленных данных. Двадцать первого мая 2012 года авторы направили те же материалы в другой, как сейчас бы сказали, менее пафосный журнал Proceedings of the National Academy of Sciences (Труды национальной академии наук США), который опубликовал статью четвертого сентября. Увы, Шарпантье и Дудна опережают литовский коллектив на два месяца. Свою аналогичную статью они направили в журнал Science восьмого июня, а уже двадцать восьмого июня статья была не только принята, но и опубликована.
Сегодня нам известен целый ряд важнейших принципов устройства всего живого на нашей планете. Генетический код, то есть буквенный код нашего генома, одинаков — что у человека, что у бактерии. У всех живых существ ДНК состоит из одних и тех же четырех оснований. Принцип кодирования белков один и тот же. Этим универсальным генетическим кодом написаны индивидуальные (персональные, не одинаковые) тексты. Они отличаются последовательностями нуклеотидов, но основной принцип формирования у них одинаков.
И это не просто констатация неких научных фактов. На самом деле из них следует крайне важный для человечества практический вывод. Ученые предположили, что направляющая (guided) РНК, которая распознает генетический текст у бактерии и вируса, должна столь же успешно распознавать те самые полтора десятка букв генетического текста и внутри клетки человека. А если эта РНК так же, как в бактериальной клетке, связана с ферментом Cas9-нуклеазой, то как раз в том месте молекулы ДНК, где произошло распознавание, может быть сделан разрез. В целом ряде публикаций, вышедших в 2012 году, такая возможность подвергалась сомнению. Однако научные статьи, которые появились в самом начале 2013 года, экспериментально подтвердили ее для клеток млекопитающих, в том числе человека. Фермент Cas9-нуклеаза очень точно разрежет нить ДНК именно в том месте, на которое указала направляющая РНК. Это значит, что мы можем вносить разрыв в генетический текст человека, состоящий из трех миллиардов букв, внутри клетки с исключительно большой точностью, а главное — с удивительной простотой.
В начале этой главы мы говорили об инструментах для побуквенного редактирования генетического текста. Упоминали мегануклеазы, нуклеазы типа цинковых пальцев и т. д. Все это сложные белковые молекулы, которые обычно приходится подбирать в каждом случае отдельно и синтезировать искусственно. Для того чтобы создать подобную распознающую белковую молекулу и проверить ее действие, мы должны синтезировать определенную молекулу ДНК, потом синтезировать нужный белок, затем этот белок выделить, почистить, доказать его эффективность. Требования к правильности структуры распознающих белков очень велики, и их создание — достаточно трудоемкий процесс, который занимает до полугода.
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ СИНТЕЗАТОР
Уже больше тридцати лет ученые имеют возможность синтезировать короткие последовательности нуклеотидов с любым порядком букв на устройстве под названием олигонуклеотидный синтезатор. Я впервые познакомился с этим чудом в конце 1980-х годов, когда работал в лаборатории Университета Джона Хопкинса в США.
Синтезатор был размером с большую микроволновую печь. Туда подвешивались десятка полтора баночек, и надо было ввести нужную комбинацию букв генетического текста (А, Т, Г, Ц). Прибор начинал завораживающе щелкать, и через пару часов у меня уже был заказанный мною и введенный по буквам фрагмент генетического текста длиной в двадцать — двадцать пять нуклеотидов.
Совершенно иные возможности представило человеку открытие иммунной системы бактерий. Всего одна универсальная нуклеаза Cas9 и несколько букв генетического текста нужны для того, чтобы направить или, если хотите, запрограммировать эту нуклеазу на разрезание молекулы ДНК в определенном месте. Остальное делают природные механизмы. Сегодня можно просто, дешево и быстро химически синтезировать короткую последовательность нуклеотидов, необходимую в качестве направляющей РНК.
Сейчас скорость синтеза принципиально не изменилась, но в любом случае часа за два можно синтезировать нужную последовательность ДНК, которая будет кодировать направляющую РНК. Еще день-другой на несложные генно-инженерные манипуляции — и ваша направляющая РНК готова к работе: она находит на ДНК клетки определенный фрагмент генетического текста, который вы задали при ее синтезе, и в этом месте Cas9-нуклеаза производит разрыв ДНК.
В отличие от сложных белок-белковых трехмерных взаимодействий, у нас происходит простое уотсон-криковское взаимодействие двух линейных структур по принципу комплементарности, то есть взаимодополняемости (см. главу 1). Требуется всего-навсего определенная физиологическая концентрация поваренной соли — как в клетке и определенная температура — тридцать семь градусов Цельсия, поскольку именно при этой температуре живут наши клетки. Больше ничего не нужно. Поэтому длительность побуквенного редактирования генома сократилась от шести месяцев до десяти—четырнадцати дней. Просто, дешево и быстро! Благодаря этому, система CRISPR/Cas9 произвела революцию в современных технологиях генной инженерии.
Оттачиваем инструменты
После того как были открыты первые виды микроорганизмов, имеющих адаптивный иммунитет к бактериофагам, ученые стали искать и другие виды бактерий, тоже имеющих подобную систему защиты, и обнаружили их достаточно много. Отчасти эта активность была обусловлена стремлением запатентовать новые типы нуклеаз или принципы функционирования направляющей РНК для последующей возможной коммерциализации, но, как мы видели на примере йогуртов Danone, даже тот интерес, за который платят деньги, быстро приводит к новым научным открытиям и технологическим прорывам.
