Разность подвижностей и, соответственно, селективность зависят в основном от концентрации ЦД, констант равновесия между анализируемыми веществами и хиральным селектором и разности подвижностей в комплексном и некомплексном состояниях анализируемых веществ. Из вышесказанного следует, что при постоянной концентрации ЦД добавка органического компонента к буферу может изменить константу равновесия в положительную (улучшение разрешения) или отрицательную (потеря разрешения) сторону. Характер изменения зависит в основном от концентрации

На рис. 91 представлено влияние мочевины, метанола и ДДСН на время миграции, проявление пика и разрешение. Для буферного раствора, насыщенного (3-ЦД (об. 1.56 %), в данном примере наблюдается наиболее быстрое время миграции (А).

Рис. 91. Влияние буферных добавок на разделение энантиомеров.

_{Условия разделения: L 40/47 см, Е=232 В/см, (анод на стороне детектора), капилляр с покрытием (4 % линейный полиакриламид), детектирование при 214 нм; буфер: 0,1 М ТВЕ, pH 8.3, добавки-.А) об. 1.56 % р-ЦД. В) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 0.1 % ДДСН. С) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 % метанол, 0.1 М ДДСН,D) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина. Е) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 %) метанол.}

С помощью добавки раствора 7 М мочевины можно поднять концентрацию ЦД (случай D). Однако, в данном случае время анализов заметно растет вследствие увеличения вязкости буфера и низкой подвижности анализируемых веществ, обусловленной высокой концентрацией хирального селектора. При этом улучшения разрешения не наблюдается. В данном случае положительное влияние оказывает добавка метанола (Е). Время миграции при этом несколько возрастает, однако достигается лучшее разрешение. Если использовать буфер, соответствующий случаю D, вместе с 0.1 М ДДСН, время миграции резко уменьшается (случай В). Это объясняется тем, что в данных условиях ДДСН и анализируемые вещества движутся в одном направлении (оба анионные), тем самым создается синергический эффект. Разрешение по сравнению со случаем (D) резко улучшается, а время анализов уменьшается. И в этом случае добавка метанола в буферную систему приводит к увеличению времени анализов, однако улучшения разрешения не наблюдается (случай С). В рассматриваемых здесь случаях улучшение разрешения определяется в основном более высокой эффективностью конкретной разделяющей среды. Значения а в этих примерах практически не изменяются.

12. Капиллярный гель-эпектрофорез

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор.

Применение гелей в электрофорезе основано на том, что биополимеры с точки зрения зарядов являются полианионами или поликатионами с одинаковыми поверхностями, поэтому разделение в постоянном электрическом поле без дополнительных вспомогательных средств становится невозможным. Поскольку эти биополимеры в самом деле резко различаются по своим размерам, добавка некоторого геля может сильнее влиять на подвижность полимера с большими размерами молекул. Это приводит впоследствии к разделению молекул по размерам, т. е. по растущим ММ. Основной областью применения гелевого электрофореза является разделение молекул ДНК, а также разделение белков, которые подвергаются денатурированию в растворе ДДСН. Кроме того, гели в классическом электрофорезе применяются обычно в качестве стабилизаторов, хотя и не дающих вклад в разделение.

Ниже будут рассмотрены некоторые типы гелей и показаны основные области их применения в КЭ.

12.1. Гели на основе акриламида

В общем случае различаются гели, обладающие определенной степенью поперечной сшивки (поперечносшитые гели), состоящие из двух мономеров, и гели, состоящие только из одного мономера (линейные гели). Последние сплетены только из линейных полимерных цепочек, и их связи основаны только на физическом взаимодействии (физические гели). Поперечносшитые гели, в отличие от линейных, состоят из отдельных полимерных цепочек, поперечно связанных друг с другом и, тем самым, обладают более жесткой структурой (химические гели), поскольку между волокнами существуют ковалентные связи. К тому же эти гели содержат в достаточном количестве поры определенного размера, что обеспечивает их высокую разделительную способность.

На рис. 92 представлены структуры применяемых радикалов-стартеров и мономеров, а также схематический разрез гелевой структуры.

Рис. 92. Структура мономера — акриламидного геля с разрезом гелевой структуры. Показаны также структуры радикалов-стартеров.

Сравнение "линейного" и "сшитого" полиакриламидов представлено на рис. 93.

Рис. 93. Схема структуры линейного и поперечносшитого полиакриламидов.

12.1.1. Поперечносшитые полиакриламидные цепи

Важнейшей предпосылкой применения геля (в классическом смысле) в капилляре является полное исключение ЭОП.

Если это условие не выполняется в достаточной степени, гель вымывается из капилляра наружу, и разделение становится невозможным. Регулирование ЭОП достигается нанесением слоя или химическим модифицированием капилляра, которые уже подробно рассматривались в разделе о способах нанесения покрытий капилляров.

За то время, когда раствор мономера смешивают с радикалом-стартером и катализатором и быстро заполняют капилляр, гель в капилляре полимеризуется.

В некоторых случаях покрытия стенок капилляра, например, виниловыми группировками, гель при полимеризации в капилляре может сшиваться с нанесенным поверхностным слоем. Этот способ дает высокую целостность покрытия капилляра и, как следствие, приводит к очень высокой эффективности. Используя этот метод с применением поперечносшитых и связанных со стенкой капилляра ковалентными силами гелей, удалось получить наивысшие эффективности в КЭ (30 млн. теоретических тарелок на метр).

Селективность гелей можно изменять с помощью выбора отношения концентрации наносимого мономера (%Т) к концентрации сшивающего агента (% С).

Свойства поперечносшитых гелей на полиамидной основе приведены в таблице 28.

Однако, перечисленные гели имеют некоторые недостатки:

— во время хранения капилляров, заполненных такими гелями (в отсутствие смачивания концов капилляра буфером) гель на концах капилляра может высохнуть, и, таким образом, капилляр становится непригодным для дальнейшей работы,

— обмен в среде буфера в капилляре невозможен или требует длительного времени,

— термостабильность такого рода гелей недостаточна. Растворенные газообразные компоненты буфера при высоких температурах образуют пузыри в капилляре. Похожий эффект наблюдается также в сильных полях (>500 В/см). Образование воздушных пузырей в капилляре, заполненном гелем, всегда приводит к локальным нарушениям геля и непригодности капилляра,