— поскольку для разделения применяют всегда один и тот же гель, неизбежны явления старения, вызванные "обескровливанием" геля. По сравнению с этим в классическом гелевом электрофорезе применяют всегда только одну зарядку гелем на один анализ, что может устранить этот эффект,

— изготовление самодельных капилляров (как было принято) требовало многих "ноу-хау" при модифицировании поверхности и, особенно, при проведении полимеризации в капилляре.

Эти проблемы стали причиной того, что попытки промышленного выпуска таких капилляров потерпели неудачу. На рис. 94 в качестве примера показана огромная производительность при разделении олигонуклеотидов таким поперечносшитым полиакриламидным гелем.

Рис. 94. Разделение поли(уридин-5'фосфата).

_{Условия разделения: L=45, Е=300 В/см, буфер: 0.1 М Тряс, «0.25 М борная кислота, 7М мочевина, 6 % Т, 5"/о С, полиакриламид, детектирование при 260 нм.}

12.1.2. Линейные полиакриамидные гели.

Вышеописанные проблемы в основном преодолеваются при применении в капиллярах несшитых гелей. Свойства этих гелей при их использовании в капиллярах сильно зависят от концентрации мономера. В таблице 29 приведены свойства и основные области применения несшитых полиакриламидных гелей.

При низких концентрациях мономера акриламида уже нельзя говорить о геле в обычном смысле этого слова, поскольку до концентрации примерно 4 % Т имеет место только жидкий, хорошо текучий высокомолекулярный раствор полимера. Эти полимерные растворы можно назвать также "жидкими гелями", "полимерными матрицами" или "буфером с ситовыми свойствами". Такие растворы можно вводить в капилляр под давлением, под которым они находятся в сосуде с буфером. Это делает возможной легкую замену "жидких гелей" в капилляре после каждого анализа. Тем самым, перед каждым разделением будет иметься в распоряжении свежая, ненапряженная разделительная матрица, что отражается положительно на стабильности метода и результатах анализа. Таким образом, в данном случае образование пузырей и высыхание капилляра исключаются. Это показано на рис. 95, где приведены данные после 400 анализов, показывающие, что капилляр все еще работоспособен.

Для достижения высокой эффективности и селективности и в этом случае следует останавливать ЭОП. Любой поток внутри капилляра уменьшает эффективность разделения. Следует также упомянуть, что в случае применения этих гелей возможна также работа с капиллярами без покрытия. В общем случае разрешение будет хуже, причем разделение начинается при достаточно высоких ММ. В покрытых капиллярах разделяются вещества с достаточно длинными цепочками.

Рис. 95. Тест на стабильность капилляра, покрытого линейным полиакриламидом (ЛПА).

_{Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см, температура 30 °C, 3 % Т, 0 % С, ЛПА, 0.1 М ТВЕ, pH 8.3. Проба: Phi X 174 RFHHK Нае III; А — 1-ый, В — 144-ый, С — 344-ый, D — 420-ый опыты.}

На рис. 96 показано разделение остаточных фрагментов в капилляре, покрытом линейным гелем (3 % Т, 0 % С).

Рис. 96. Разделение остаточных фрагментов ДНК в капилляре, покрытом ЛПА.

_{Условия разделения: L=40/47 cm, Е=150 В/см, I=50 °C. Буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3, 3 % Т, 0 % С ЛПА, пробы: pBR 322 MSP I, pBR 322 Hae III, детектирование: 254 нм.}

Поскольку все фрагменты присутствуют в эквимолярных соотношениях, но большие фрагменты обладают большим числом адсорбционных центров, с ростом длины цепочек растет и площадь пиков. По этой причине маленькие фрагменты дают маленькие пики и, вследствие малого сопротивления миграции в геле, на фореграммах проявляются в первую очередь. Нумерация фрагментов ДНК в данном случае проводилась в предположении роста молекулярных размеров. Число ступеней разделения здесь равно примерно 600 тысячам теоретических тарелок на метр. При таких высоких числах ступеней разделения капилляры желательно располагать в горизонтальном положении, поскольку поворот капилляра может привести к потере эффективности. Эти потери эффективности, зависящие от расположения капилляра, наблюдаются в КЭ при очень высоких эффективностях (> 1 млн. теоретических тарелок).

Большое влияние на селективность и эффективность оказывает также температура. Вообще эффективность падает с ростом температуры, однако для фрагментов некоторых размеров может достигаться лучшее разрешение, что обусловлено улучшающейся селективностью. Влияние температуры, напряженности поля, пористой структуры геля и буферных добавок на селективность и последовательность миграции анализируемых веществ будет рассматриваться в дальнейшем при обсуждении моделей миграции.

В случае более высоких концентраций мономера растворы полимера становятся высоковязкими, поэтому начиная с концентрации 8 % их следует полимеризовать в капилляре. Селективность этих высокомолекулярных линейных гелей (например 12 % Т) схожа с селективностью поперечносшитых гелей, которые всегда следует полимеризовать в капиллярах. Поскольку, однако, в таких гелях не образуются ковалентные связи цепочек между собой, а также со стенками капилляров, сильное напряжение геля не приводит к разрушению его структуры. Эта незафиксированность цепочек в геле придает полимеру большую гибкость и, вследствие этого, повышает его продолжительность жизни. На рис. 97 представлено разделение олигонуклеотидного стандарта в покрытом капилляре, заполненном 12 % Т ЛПА.

Рис. 97.Разделение смеси полидеоксиаденозииа (pd (А) 40–60) с олигонуклеотидами в капилляре, заполненном гелем 12 % Т, 0 % С.

_{Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см; буфер: 0.1 М ТВЕ, 7 М мочевина, pH 8.3.}

Эти гели находят применение также в определении последовательности нуклеотидов в ДНК, причем для детектирования в данном случае применяют лазерноиндуцируемую флуоресценцию. Гели непроницаемы для УФ-лучей с длиной волны меньше 250 нм. Кроме того, поскольку в распоряжении имеются очень малые пробы, в данном случае требуется очень высокая чувствительность детектора. Граница определения в данном случае составляет примерно 10^-11 М.

12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН

КГЭ применялся почти исключительно для разделения молекул ДНК, поскольку чувствительное определение белков в гельзаполненных капиллярах невозможно из-за поглощения самого полиакриламида в области относительно коротких УФ-лучей (<250 нм). Взаимодействия белков с гелями также могут играть определенную роль, так что до настоящего времени в гельзаполненных капиллярах описано только успешное разделение белков, денатурированных ДДСН.

Обычно белки соответственно своим значениям р1 обладают различным зарядом молекул, на этом основано их разделение при применении нормальных буферных систем в условиях, исключающих денатурацию. Для достижения разделения по ММ белки должны обладать одинаковым отношением заряда к поверхности. В этом случае возможно разделение в геле по молекулярным размерам или ММ.