Дальнейший рост концентрации хирального селектора может резко ограничить подвижность анализируемых веществ, так что они; Детектируются очень близко к ЭОП. В этом случае из-за слишком малой зоны движения разделение энантиомеров может стать невозможным. Кроме того, при повышении концентрации ЦД растет вязкость буфера, что замедляет ЭОП и увеличивает время анализов. В капиллярах с заторможенным ЭОП рост концентрации ЦД также приводит к уменьшению подвижности анализируемых веществ, повышению вязкости буферной системы и, вследствие этого, к увеличению времени анализов.
Наряду с уменьшением разрешения вследствие небольшого времени пребывания в капилляре при высоких концентрациях ЦД могут наблюдаться также и другие эффекты. В некоторых случаях оказывается, что уже при очень низких концентрациях ЦД наблюдается хорошее разделение пар энантиомеров (разрешение больше 1.5). Однако, при более высоких концентрациях хирального селектора (об. 4-10 %) разрешение снова падает. При более высоких концентрациях ЦД время пребывания D- и L-форм анализируемых веществ в ЦД увеличивается, однако разность этих времен постоянно уменьшается.
Тем самым, разрешение пиков при разделении в этой системе уменьшается или даже совершенно исчезает. Экстремальный случай оптимизации концентрации ЦД приведен на рис. 87.
Рис. 87. Изменение последовательности выхода энантиомеров при различных концентрациях ЦД.
Условия разделения (слева): L=50/57 см, Е=350 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, pH 7.7 с об. 0.5 % гидроксипропил-fr-ЦД. (Справа): L=80/87cm, Е=30 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, pH 7.0 с об. 15 % гидроксипропил-Р-ЦД; детектирование при 214 нм.
При очень низких концентрациях хирального селектора в системе достигается хорошая селективность. Если повысить концентрацию, разрешение полностью исчезает и снова появляется при очень высоких концентрациях ЦД. Это показано на рис. 88, где представлены зависимости относительных времен миграции от концентрации ЦД.
Рис. 88. Зависимость относительных времен миграции D- и L-дансил-фенилаланина от концентрации гидроксипропил — Р-ЦД.
Хорошо видно, что относительная миграция с ростом концентрации ЦД резко падает и примерно при об. 6 % достигает минимума. В этой области разрешение зависит только от различия времен нахождения D- и L-форм в ЦД. При концентрациях больше об. 6 % подвижность анализируемых веществ практически не изменяется. Следует отметить, что разрешение снова возрастает при концентрациях ЦД больше об. 12 %. Это можно объяснить только тем, что при высоких концентрациях образуются диастереомерные комплексы между ЦД и анализируемым веществом. Диастереомеры по своей природе проявляют различные физические свойства, и поэтому их можно разделить. Из-за различия механизмов разделения в начале и конце кривых последовательность выхода энантиомеров неизбежно обращается.
11.6. Оптимизация значений pH
Значение pH в КЭ является одним из важнейших параметров оптимизации. С помощью значений pH можно не только воздействовать на ЭОП, но и перевести анализируемые вещества в определенную ионную форму. Из этого вытекают различные электрофоретические подвижности, которые приводят затем к разделению анализируемых веществ. Если используются незаряженные ЦД, пара энантиомеров при определенном pH должна иметь такую собственную подвижность, чтобы смогла пройти сквозь псевдостационарную фазу (в данном случае — ЦД).
На рис. 89 в качестве примера представлена зависимость разделения рацемированной смеси от значения pH. При низких значениях pH анализируемые вещества практически не обладают собственной подвижностью и проходят через детектор со скоростями, близкими к ЭОП, не разделяясь. Из рис. 89 также видно, что при низких значениях pH ЭОП очень мал.
Рис. 89. Влияние значений pH на разделение производных дигидропиридииа.
Условия разделения: L=50/57cm, Е=440 В/см, буфер: 20 мМ фосфат, об. 0.4 % гидроксипропил-р-ЦД, различные значения pH; детектирование при 214 нм.
При средних значениях pH анализируемые вещества обладают достаточно высокой собственной подвижностью, так что в этом случае различие в подвижности между D- и L-формами может привести к переносу. Анализируемые вещества в данном случае должны пройти достаточно большой эффективный участок пути в капилляре. Потеря разрешения при высоких значениях pH часто объясняется тем, что очень высокий ЭОП не дает достаточно времени анализируемым веществам для разделения в капилляре. Высокий ЭОП приводит к слишком коротким временам пребывания анализируемых веществ в капилляре. При очень высоких значениях pH ЦД сами могут депротонироватъся, из-за чего селективность снова изменяется. Если ЦД имеет одинаковый заряд с анализируемыми веществами, из-за электростатического отталкивания хиральные отличительные черты теряются.
11.7. Оптимизация фоновых электролитов
После выбора подходящего хирального селектора и оптимального значения pH следует оптимизировать также ионный состав разделяющего буфера. Как показано на рис. 90, подвижность буферных ионов влияет на форму пика и разрешение анализируемых веществ.
Рис. 90. Влияние фонового электролита на форму и разрешение пиков.
Условия разделения: 1=20/27 см, покрытие полиакриламидное, Е=370 В/см (выход заземлен), об. 0.3 % гидроксипропил-р-ЦД, детектирование при 214 нм, пробы: дансил-фенилаланин (1), производное дигидропиридина (2). А) 10 мМ лимонная кислота, pH 6.0. В) 25 мМ MES/Tpuc, pH 6.0. С) 20 мМ фосфатный буфер, pH 6.0.
Во всех трех случаях выдерживались одинаковые условия ввода пробы, и все условия разделения, за исключением буферных ионов, поддерживались одинаковыми. Ясно видно, что в случае применения в качестве буфера лимонной кислоты получается лучшее разрешение и, как следствие, более высокая эффективность разделения. Это приводит также к большей чувствительности системы. Этот пример показывает, что и при низких значениях а путем улучшения эффективности можно достичь достаточного хорошего разрешения анализируемых веществ.
11.8. Буферные добавки
Наряду с уже описанными параметрами определяющее влияние на разделительную способность хирального селектора могут оказывать многие добавки к разделяющему буферу. Однако заранее невозможно предсказать, может ли добавка таких компонентов, как органические растворители, комплексообразующие средства, детергенты и т. д., привести к улучшению или исчезновению разделения.
В некоторых публикациях предпринята попытка представить модель такого поведения. В нижеописанном уравнении приведены основные факторы, влияющие на различия подвижностей.
Здесь
Δμ — разность подвижностей энантиомеров,
μ1 — подвижности энантаомера 1 или 2 в свободном растворе,
μ2 — подвижности комплексов "энантиомер-ЦД",
[С] — коцентрация хирального детектора,
Ка, Кв — констаны равновесия между энантиомером А или В и ЦД.
