1) ДДСН-ЦД. Из смешанных методов этот вариант наиболее распространен. Мицеллярная система в данном случае отвечает за разделение отдельных компонентов пробы, а ЦД в качестве хирального селектора — за разделение компонентов пробы в чистых онантиомерах. Однако, при применении детергентов вместе с ЦД часто наблюдается их отрицательное влияние. Детергенты с длинными алкановыми цепочками могут внедряться внутрь ЦД-колец и препятствовать воздействию хирального селектора.
2) Добавка второго хирального селектора, В этом методе в буферной системе находятся два различных хиральных селектора. Однако этот способ до настоящего времени только в отдельных случаях приводил к улучшению разрешения при разделении энантиомеров. Например, комбинация хирального краун-эфира с ЦД для некоторых проб проявляет синергический эффект. Иногда к улучшению селективности приводит также использование двух различных ЦД в одной буферной системе. Однако, в общем случае введение второго селектора и, таким образом, второй равновесной системы в буфер приводит к потере селективности.
3) Смешанные мицеллообразующие системы. Использование чистых хиральных детергентов в качестве мицеллобразователей во многих случаях приводит к плохому разрешению из-за несимметричности пиков и плохой эффективности. Добавление ДДСН как добавочного мицеллообразователя в некоторых случаях разделения приводило к улучшению формы пика и, тем самым, к лучшему разрешению. Смешанные мицеллы, образующиеся при добавлении ДДСН, сами ускоряют обменные процессы в мицеллах и уменьшают взаимодействия с хиральным селектором (эффект разбавления).
Поскольку в настоящее время ЦД и их производные обладают наиболее широким спектром применения в качестве хиральных селекторов, а также наибольшими перспективами в КЭ, остановимся на них более подробно.
Реакции, в результате которых получаются производные ЦД, позволяют проводить синтез множества новых хиральных селекторов с существенно разным воздействием на хиральные различия между селектором и анализируемым веществом. В общем случае за хиральные отличительные свойства отвечают гидрофобные и ионные взаимодействия, а также стерические эффекты и образование мостиковых водородных связей.
Было показано, что при разделении энантиомеров важную роль наряду с выбором подходящего хирального селектора играют и другие параметры электрофоретической системы, которые требуют дальнейшей оптимизации. Например, на процесс оптимизации разделения энантиомеров решающее влияние оказывает величина pH. Вследствие того, что разделение энантиомеров методом КЭ основано на различии в подвижностях между D- и L-формами, анализируемые вещества необходимо перевести в ионную форму, что обеспечивается подходящим значением pH. При электрофоретическом движении анализируемых веществ через "квазистациомарную" фазу (в данном случае — ЦД) происходит разделение пары энантиомеров. Важнейшими оптимизирующими параметрами в данном случае являются концентрация хирального селектора в используемой буферной системе, сама буферная система (вид фонового электролита), а также другие буферные добавки, такие как ДДСН, метанол и др. Их действие на разделение энантиомеров будет рассмотрено ниже.
11.3. Капилляры с ЭОП и без него
Как правило, проблемой в разделении энантиомеров является невысокая селективность и, вследствие этого, длительные времена анализов, даже в случае, когда найдем подходящий хиральный селектор для разделения. Причиной этого являются небольшие различия в подвижностях D- и L-форм анализируемых веществ, а также наличие сильного ЭОП, который перекрывает эффект разделения в немодифицированных капиллярах. Небольшие различия в подвижностях приводят к разделению только в тех случаях, когда эффективные участки движения максимальны. Это означает, что анализируемое вещество в электрическом поле должно двигаться от точки ввода до детектора самостоятельно. Наличие ЭОП в данном случае мешает разрешению. Для достижения максимального разрешения по возможности за короткое время покрытые (модифицированные) капилляры используются при сильно заторможенном ЭОП. При этом можно использовать очень короткие капилляры (7-20 см) и сильные электрические поля (до 1000 В/см). При использовании подходящего хирального селектора это приводит к очень малым временам анализа при высоком разрешении. Различие между немодифицированным и покрытым капилляром продемонстрировано на рис. 84.
Рис. 84. Разделение энантиомеров гексабарбитала в капилляре с покрытием (А) и без покрытия (В).
Условия разделения: 0.1 М ТЕЕ, pH 8.3, детектирование при 214 нм; ввод пробы: 1 с, 2 кВ, об. 1.56%р-ЦД, t=25 °C. А) Покрытие капилляра: 4 % линейный полиакриламид, Е=710 В/см (выход заземлен), L-7/27 см. В) Капилляр без покрытия, Е=400В/см. Ь=50/57 см.
Заметно более высокая эффективность для непокрытого капилляра основана на том, что ЭОП перекрывает подвижность анализируемых веществ, и они очень быстро проходят через детектор. Здесь ясно видно, что более высокая производительность за более короткое время при разделении достигается при применении покрытого капилляра. Использование покрытого капилляра в выборе подходящего хирального селектора играет большую роль, так как в данном случае можно много быстрее определить применимость данного селектора, т. е. его селективность.
11.4. Выбор подходящего LLQ
При использовании ЦД в качестве хиральных селекторов решающее влияние на селективность оказывает не только тип ЦД, но и тип заместителя в производных ЦД. Растворимость ЦД в воде также может резко увеличиться при применении производных. Это показано для тестовой смеси различных типов ЦД и их производных на рис. 85.
Рис. 85. Разделительный потенциал различных типов ЦД.
Условия разделения: L=50/57 см, Е= 350 В/см, буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3; детектирование при 214 нм, об. 1.5 % ЦД; пробы: 1 — d,1-гексабарбитал, 2 — (!1-дансил-фенидаланин; А) α-ЦД, В) гидроксилропил — α-ЦД, С) метил — β-ЦД, D) гидроксипропил-Р-ЦД.
11.5. Оптимизация концентрации ЦД
Следующая важная составная часть оптимизации состоит в установлении подходящей концентрации ЦД. В зависимости от типа анализируемых веществ с ростом концентрации ЦД могут наблюдаться улучшение разрешения, потеря или даже инверсия разрешения. Это может приводить к неправильным выводам о различных механизмах разделения энантиомеров с помощью ЦД. На рис. 86 показано влияние концентрации ЦД на разделение энантиомеров.
Рис. 86. Влияние концентрации гидроксипропил — р-ЦЦ на разрешение пиков при разделении производных дигидропиридина.
Условия разделения: L=50/57 см, Е=350 В/см; буфер: 0.1 М Т BE, pH 8.3, различные концентрации ЦД, детектирование при 214 нм.
В немодифицированной с помощью ЦД буферной системе отрицательно заряженные энантиомеры обладают высокой подвижностью относительно ЭОП, так как они без сопротивления могут проходить сквозь буфер (нижняя электрофореграмма).. Уже небольшие добавки хирального селектора вызывают сильное уменьшение подвижности анализируемых веществ, причем в этом случае наблюдается вполне Достаточная селективность. Разделение при очень низких концентрациях ЦД объясняется различным временем пребывания D- и L-форм в ЦД. Энантиомер с большим временем пребывания в ЦД проявляет меньшую подвижность и детектируется ближе к ЭОП.
