Рис. 12. А: Достигаемое число теоретических тарелок в капиллярном электрофорезе с учетом и без учета джоулева тепла. В: Зависимость уширения полос вследствие температурного эффекта от напряженности поля при различных диаметрах капилляра.
5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии
Уменьшение электропроводности буфера устанавливает, однако, некоторые ограничения. Если между электропроводностью в буфере и в зоне пробы существует большое различие, то локальное нарушение электрического поля приводит к искажениям зон и, вследствие этого, к уменьшению эффективности разделения. Если электропроводность внутри зоны пробы больше, чем в несущем электролите, то уменьшение сопротивления приводит к снижению напряженности поля. Из-за этого молекулы пробы в зоне концентрационного максимума перемещаются медленнее, чем на краях. Это приводит к сильному искажению зон с медленным подъемом и быстрым падением в них концентрации веществ. В другом случае возникает пик с большим "хвостом". Симметричный пик получается только, если электропроводности в зоне пробы и в буфере одинаковы.
Рис. 13. Увеличение силы тока в зависимости от напряжения и внутреннего диаметра капилляра.
Условия: прибор для КЭ — МП-lipore Quanta 4000; капилляр — 360 мкм (внешний диаметр), 50/56 см; буфер (А): 20 мМ борат, pH 10.0; буфер (В): 25 ММ ЦАПК. pH 11,0.
Поэтому концентрацию буфера необходимо подбирать применительно к конкретной проблеме разделения (диссоциация и подвижность пробы). Кроме того, разница в подвижности между ионами пробы и буфера может привести к изотахофоретическому эффекту. Это дает в большинстве случаев треугольную форму пика, которая вызывает проблемы при интегрировании.
При этом, если электропроводность зоны пробы больше, чем у разделительного буфера, это приводит к разбавлению пробы при ее вводе. Это объясняется законом Кольрауша, который требует постоянной электропроводности на всем участке разделения.
i — ионы в зоне разделения, ωi — функция Кольрауша.
Если при этом существует еще и разница в подвижности между ионами пробы и буфера, то происходит искажение формы пика. Эта сложная взаимосвязь наглядно обобщена еще раз в таблице 3.
Электропроводность буфера в зонном электрофорезе должна быть одинаковой на всем участке разделения. Только этим обеспечивается то, что напряжение на участке разделения падает равномерно и скачков напряженности поля не возникает.
Появление градиента напряженности электрического поля в зоне перемещения молекул пробы определяется ионной силой (или концентрацией) буфера. Если электропроводностью зоны пробы нельзя пренебречь по сравнению с электропроводностью буфера, это приводит к уширению полос. Эффект усиливается с ростом различия в подвижностях ионов пробы и буфера.
Рис. 14. Схематическое объяснение уширения полос электрической дисперсии
Из-за скачка напряжения на границе пиков происходит деформация и образуются крутой и пологий края пика. На рис 15 представлена зависимость значений Н от концентрации боратного буфера для четырех соединений. Значения Н при этом для всех веществ с увеличением концентрации буфера снизились, например, для (1-гидроксибензойной кислоты с 31 мкм до 4 мкм.
Для ионов пробы с большим отличием в подвижности от ионов буфера значение Н на несколько порядков выше, чем в случае пробы, имеющей подвижность такую же, как у ионов буфера.
Эти явления более подробно рассмотрены в главе "Непрямое УФ-детектирование", поскольку при этом способе детектирования часто необходимо использовать маленькие концентрации буфера.
Рассмотрим эти проблемы на примере разделения гомологического ряда карбоновых кислот.
В то время как низшие гомологи детектируются с отчетливым искажением, каприловая кислота выходит в виде симметричного пика. Карбоновые кислоты, перемещающиеся медленнее, обладают значительно меньшей подвижностью, чем ионы буфера, и поэтому детектируются в виде асимметричных пиков с увеличивающимися "хвостами".
Рис. 15. Влияние концентрации буфера на уширение полос.
Условия: прибор для КЭ — Beckman Р/АСЕ 2000; капилляр — 50 мкм, 54/51 см; поле 400 В/см; буфер: борат, pH 8.5; ввод пробы — давлением, 1 с.; детектирование — 214 нм: А — фенилтриметиламмонийхлорид, В — фталевая кислота, С — п-гидроксибензойная кислота, D — бензиновый спирт.
5.4. Адсорбция на стенках
Молекулы пробы могут адсорбироваться на стенках за счет взаимодействия с отрицательно заряжеными силанольными группами кварца. При нейтральных и щелочных условиях разделения многие силанольные группы депротонируются и способствуют адсорбции положительных ионов пробы на стенке. В результате этого %-потенциал, образовавшийся на поверхности кварца, изменяется и, как следствие, изменяется подвижность электроосмотического потока, из-за чего происходит изменение времени выхода всех пиков. Кроме этого, из-за сильной адсорбции молекул пробы на стенках капилляра уменьшается интенсивность пика и это приводит в экстремальном случае к асимметричным пикам с большими "хвостами". Обработка таких пиков трудна, а часто невозможна.
Рис. 16. Влияние разницы в подвижности между ионом пробы и ионом буфера на форму пика.
Условия разделения: L=50/57 см; внутренний диаметр — 75 мкм; буфер — 5 мМ динитробензойная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид) pH 9.0;Е=-431 В/см; детектирование — непрямое, УФ 214 нм; проба — карбоновые кислоты по 25 ррм каждой.
Из-за локальных воздействий на поверхностный потенциал кварца следует ожидать дополнительного изменения профиля потока, который отклоняется от идеальной "поршнеобразной" формы, что также способствует уширению полос. Особенно отчетливо можно наблюдать это явление в пробах, содержащих многозарядные положительные ионы. Вследствие повышения концентрации буфера ионообменное взаимодействие между пробой и силанольными группами подавляется, благодаря чему анализ становится возможным.
Особенно важным становится подавление адсорбции на стенках при разделении белков с помощью КЭ. В этом случае можно показать, что уже повышение емкостного отношения (как меры адсорбции на стенках) с 0.001 до 0,1 приводит к росту высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) с 0.5 мкм до 15 мкм.
При повторных вводах растворов, содержащих белок, часто наблюдается изменение времени выхода. Для раствора проблема решается в основном двумя различными способами. Согласно первому можно связать ковалентно с поверхностью капилляра гидрофильный слой, второй состоит в возможности добавления к разделительному буферу веществ, которые препятствовали бы ионному обмену.
В представленном на рис. 17 примере разделения белков ионообменное взаимодействие между стенками капилляра и молекулами белка подавляется введением в буфер добавок ДАП (1,3-диаминопропана). Из-за экранирующего действия ДАП пик лизоцима при повышении концентрации ДАП всегда симметричен, и при этом даже возрастает высота пика.
