При напряжении от 100 до 35000 В, а также эффективном заряде от 1 до 10 достигается величина до 107 теоретических тарелок на метр. Эта величина показывает, что в этом отношении КЭ превосходит ВЭЖХ.
Предсказанное высокое число теоретических тарелок было измерено в заполненных гелем капиллярах для молекул ДНК. Молекулы ДНК представляют собой особый случай, так как из-за большого числа отрицательных зарядов они не вступают в обменное взаимодействие с поверхностью капилляра. С белками достигнуть такого числа тарелок не удается, хотя с покрытыми капиллярами можно получить до 106 тарелок на метр.
Необходимо заметить, что в хроматографии прохождение всех проб через детектор после элюирования на колонке и соответствующего разбавления всегда происходит с постоянной скоростью. Однако в КЭ с детектированием в колонке скорость перемещения проб к окну детектора различна. Только поэтому возможно выравнивание достижимого числа теоретических тарелок в ВЭЖХ и в КЭ.
Для практического расчета числа теоретических тарелок можно использовать ширину пика на половине высоты и время удерживания (время выхода пика). В этом случае число теоретических тарелок рассчитывается по формуле:
N = 5,54∙(t/b)2
t — время удерживания вещества (выхода пика), b — ширина пика на половине высоты.
На практике кроме продольной диффузии в КЭ существуют другие эффекты, которые способствуют уширению пиков. К этим причинам уширения полос в КЭ относятся:
— адсорция пробы стенками капилляра,
— искажение плоского "поршневидного" профиля потока из-за температурного эффекта,
— наложение электроосмотического потока,
— слишком длинная зона ввода пробы,
— слишком большая концентрация пробы,
— разница в подвижностях буфера и анализируемых ионов.
Как и в ВЭЖХ, в КЭ имеет место аддитивность дисперсий (σ2) при совместном действии различных причин, приводящих к суммарному уширению полос. В итоге это приводит к уменьшению числа теоретических тарелок N или, соответственно, к увеличению значения Н.
σ2 = σ2VU + σ2MU + σ2LD + σ2DE + σ2WA + σ2T+ σΔμ
σ2 — дисперсия пика при гауссовой форме, индексами обозначены причины дисперсии:
VU — перегрузка по объему, MU — перегрузка по массе, LD — продольная диффузия, DE — детектирование, WA — адсорбция на стенках, Т — температурные эффекты, Δμ — разница в подвижности иона пробы и буфера.
Впоследствии мы остановимся на некоторых из этих причин более подробно. Особый интерес при этом будут представлять прежде всего эффекты перегрузки, ионной силы буфера, адсорбции на стенках, температурные эффекты и разница в подвижности ионов пробы и буфера.
5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов
В результате наложения поля в капилляре протекает электрический ток. Этот ток, помимо других причин, зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра. Приведенная ниже формула описывает связь между мощностью электрического тока и некоторыми характеристиками процесса разделения.
P = U∙I = R∙I2 = U2∙d2∙(π∙k/2L)
где Р — мощность, d — внутренний диаметр капилляра, k — удельная электропроводность буфера.
Из уравнения видно, что мощность зависит от квадрата напряжения и квадрата радиуса капилляра. Например, при удвоении внутреннего диаметра капилляра напряжение уменьшается в два раза. При этом мощность остается постоянной. Поэтому время анализа при использовании капилляра большого диаметра выше.
Отвод тепла, выделяемого за счет электрической мощности, происходит исключительно через стенки капилляра, так что в буфере возникает радиальный температурный градиент, а с ним и градиент вязкости, перпендикулярный электрофоретическому потоку. При этом тепло будет отводиться через различные материалы с различной скоростью.
Рис. 11. Градиент температуры в буфере для разделения и на стенках капилляра.
В то время как вода обладает относительно высоким тепловым сопротивлением (6.0∙10-3 Вт/см К), через кварц тепло будет отводиться быстро (тепловое сопротивление 1.4∙10-2 Вт/см К). Типичное значение для разницы температур между внутренними и внешними стенками капилляра лежит в интервале между 0.3 и 0.7 °C.
Как показывают расчеты, при этом образуется параболический температурный градиент. Середина капилляра нагревается наиболее сильно, и температура здесь может быть на 10 °C выше, чем на внутренней стенке капилляра. Радиальный температурный градиент вызывает градиент вязкости, который оказывает влияние на профиль потока. Поэтому вещество перемещается медленнее в зоне с высокой вязкостью (стенки капилляра), чем в зоне с меньшей вязкостью (середина капилляра). Образование температурного градиента сильно зависит от размеров капилляра, электропроводности буфера и охлаждения капилляра. Охлаждение капилляра усиливает температурный градиент, однако оно необходимо для того, чтобы избежать дегазации и локального перегрева. Различие в вязкости между серединой капилляра и стенками приводит к различию переноса и, как следствие, к уширению полос и потере эффективности разделения.
Влияния радиальных градиентов температуры и вязкости можно избежать только за счет уменьшения диаметра капилляра.
Разница в температуре между серединой капилляра и стенками в цилиндрической трубке возрастает пропорционально квадрату диаметра капилляра. Поэтому в КЭ применяют очень тонкие капилляры (диаметром от 50 до 100 мкм). Сам градиент температуры не может быть измерен из-за очень малых размеров капилляра. При уменьшении диаметра оптическая плотность слоя и, вместе с тем, чувствительность обнаружения уменьшаются (закон Ламберта-Бера). Другая возможность уменьшения влияния джоулева тепла состоит в снижении концентрации буфера и/или применении буфера с низкой ионной электропроводностью.
Так как повышение температуры увеличивает электропроводность буфера в капилляре, ток при постоянном напряжении в начале анализа изменяется до тех пор, пока не образуется стабильный температурный градиент. В этом состоянии основное джоулево тепло отводится через стенки капилляра. При неэффективном охлаждении температура буфера повышается, и поэтому ток увеличивается непропорционально приложенному напряжению. При этом перестает выполняться закон Ома.
В целом действием температурных эффектов можно пренебречь при работе в области выполнения закона Ома. Максимальное необходимое напряжение зависит, таким образом, от диаметра капилляра, электропроводности буфера и эффективности охлаждения.
Как ясно видно из рисунка, применение капилляра с очень маленьким внутренним диаметром позволяет повысить электрическое сопротивление, при этом одновременно увеличится линейная область U/I-кривой. Так, к примеру, с исследуемым буфером (рис. 12 А) в капилляре с внутренним диаметром 50 мкм можно работать до 25 кВ. В то же время для капилляра диаметром 100 мкм рабочая область не превышает примерно 12 кВ.
Можно повысить электрическое сопротивление, применяя цвиттер-ионный буфер. Уменьшая удельную электропроводность, можно, как показано на примере буфера, содержащего циклогексиламинопропановую кислоту (ЦАПК), работать вплоть до 20 кВ даже с капилляром, имеющим внутренний диаметр 100 мкм.
