Многие предметы искусства американскими коллекционерами были куплены в Европе в 1920-1930-е, когда из-за войн и революций это можно было сделать на весьма выгодных условиях. Некоторые шедевры попали в собрание Эндрю Меллона из советской России, прямо из экспозиции Эрмитажа (позже он подарил их «народу Соединенных Штатов»). За «Мадонну Альба» кисти Рафаэля Меллон заплатил более миллиона долларов. Эта сумма почти полвека оставалась рекордной ценой для произведения искусства. Благодаря деятельности собирателя экспозицию вашингтонской галереи украшают шедевры Веронезе, Ван Дейка, Боттичелли, Перуджино, Тициана — все из бывшего собрания санкт-петербургского музея.

В своем завещании Меллон выразил надежду, что и другие коллекционеры пожертвуют произведения искусства во вновь созданную Национальную галерею, «чтобы они могли доставлять наслаждение всем людям и стали ценнейшим вкладом в культурную жизнь страны». Его примеру последовали братья Сэмюель и Раш Кресс, подарившие большую коллекцию картин и скульптур итальянской школы, включавшую произведения XIII–XVI веков. Приняв на себя обязанности кураторов Галереи, они также сумели расширить собрание итальянского искусства, сделав его одним из крупнейших в мире. С их помощью музеем были приобретены коллекции французской живописи и скульптуры XVIII века, несколько небольших собраний раннего немецкого искусства, венецианской и нидерландской живописи.

Из коллекции Питера и Джозефа Уйденеров поступило значительное собрание скульптуры, произведения прикладного искусства, среди живописных полотен, принадлежавших им, выделяются две работы Эль Греко — «Богоматерь со святой Мартиной и святой Инессой» и «Святая Мартина и нищий». По завещанию в собственность Национальной галереи перешла обширная коллекция работ французских художников-импрессионистов и постимпрессионистов Честера Дейла, который еще при жизни дарил музею превосходные произведения. Больше тридцати тысяч гравюр, среди которых — Дюрер, Рембрандт, Лука ван Лейден, обогатили фонды благодаря Лессингу Розенвальду.

Пол Меллон и Эйлса Меллон-Брюс — сын и дочь основателя Галереи — унаследовали его интерес к собирательству произведений искусства. Пол Меллон предоставил музею свою коллекцию английской живописи, а Эйлса Меллон-Брюс приобрела для него шедевр Леонардо да Винчи «Портрет Джиневры Бинчи», работу Гойи «Портрет графини Чонсон» и множество картин французских художников.

Национальная галерея размещается в двух зданиях рядом с Капитолием. Первое, открытое для публики в 1941, спроектировал выдающийся архитектор Джон Рассел Поп. Оно построено в стиле классицизма и облицовано мрамором, на фасадах — порталы и монументальные ионические портики, стены украшены нишами и пилястрами. В центре Галереи Поп поместил ротонду, ее металлический купол располагается на колоннах из темно-зеленого мрамора. Этот корпус Национальной галереи — самое большое в мире здание, облицованное этим дорогим камнем.

В Галерее в отличие от большинства музеев мира принята раздельная экспозиция: картины выставлены в залах живописи, статуи и скульптурные портреты — в других. Стены каждого зала оформлены в стиле той эпохи, произведения которой здесь представлены. В залах раннеитальянского, фламандского и немецкого искусства они облицованы штукатуркой, в залах позднеитальянской живописи затянуты тканью, в голландских залах с произведениями Рубенса, Ван Дейка и Рембрандта — на стенах дубовые панели… Еще одна интересная особенность — картины развешены на расстоянии вдвое большем, чем принято в других музеях. Это позволяет посетителям сконцентрироваться на каждом полотне или скульптурном произведении.

Новый, Восточный, корпус Галереи, созданный по проекту архитектора Йон Мин Пея, был открыт в 1978. Постоянно растущая коллекция уже к началу 1960-х едва могла вместить новые поступления. Было решено возвести дополнительное здание, предназначенное для современного искусства. Еще при строительстве первого зарезервировали участок на случай расширения музея. Так как он имел в плане трапециевидную форму, архитектор, разделив фигуру, получил в результате два треугольных здания. В первом расположились выставочные залы, где проводятся временные экспозиции, во втором — научный центр с библиотекой, фотоархивом и служебными помещениями.

Каждый день в Галерее проводятся несколько типов экскурсий — обзорная (по всему музею), тематическая (по определенному периоду истории искусства) и лекции о какой-либо картине или скульптуре. Ведется и научная деятельность, уже в 1950-е начались исследования в области художественных материалов. Современные ученые заняты решением проблемы выцветания красок из-за яркого освещения в залах, анализом живописных пигментов и многого другого. Центр по изучению искусства проводит мероприятия с участием видных европейских и американских ученых и специалистов, конференции и семинары.