Главными причинами конфликта, зревшего еще до распада СССР, явился, с одной стороны, рост националистических настроений в Молдове, с другой стороны — сепаратистские устремления руководства находящегося на территории Молдовы никем не признанного самопровозглашенного государственного образования — так называемой Приднестровской Молдавской Республики (ПМР). Конфликт имел и экономические предпосылки: на территории Приднестровья была сосредоточена большая часть промышленных предприятий Молдовы.

Рост молдавского национализма подогревался тем, что сформированному в мае 1989 года Народному фронту Молдовы (НФМ) удалось в процессе выборов провести своих сторонников в Верховный Совет Молдавской ССР. Представители НФМ сформировали мононациональное руководство республики, а всем основным положениям своей программы придали форму закона. Идеологи НФМ стремились обеспечить, с их точки зрения, более справедливый режим учета национальных интересов молдавской нации, что привело к фактам дискриминации по отношению к национальным меньшинствам и столкновениям на этнической почве. При этом к началу конфликта на территории Молдовы проживали 65 % молдаван, 14 % украинцев и 13 % русских (по данным переписи 2004 года, на территории республики помимо молдаван (75,8 %) проживают украинцы (8,4 %), русские (5,9 %), гагаузы (4,4 %) и др).

Дискриминация выразилась, в частности, в языковой политике нового молдавского руководства. Кроме того, в стране значительную популярность получили прорумынские настроения. Целью унионистов было присоединение Молдовы к Румынии. Начали раздаваться лозунги: «Румыны, объединяйтесь», «Молдавия — для молдаван» и «Русских — за Днестр, евреев — в Днестр».

Молдавские националисты сорвали военный парад 7 ноября 1989 года, а в День советской милиции предприняли попытку штурма здания республиканского МВД. Была разгромлена газета «Молодежь Молдавии», подожжена редакция газеты «Вечерний Кишинев». Началось увольнение просоветски настроенных граждан. 20 мая 1990 года подразделение НФМ, включавшее переодетых полицейских, попыталось водрузить румынский флаг над г. Бендеры. 5 июня 1990 года Верховный Совет Молдавской ССР установил новое название государства — Республика Молдова. Была принята государственная символика, а советская — упразднена.

В этих условиях 2 сентября 1990 года в Тирасполе прошел Второй Чрезвычайный Съезд депутатов всех уровней Приднестровья, провозгласивший образование Приднестровской Молдавской Советской Социалистической Республики (в составе СССР), с включением в ее состав Григориопольского, Дубоссарского, Рыбницкого, Слободзейского районов и городов Бендеры, Дубоссары, Рыбница и Тирасполь. Однако 22 декабря 1990 года президент СССР Михаил Горбачев подписал указ «О мерах по нормализации обстановки в Молдавской ССР», предписывавший распустить Приднестровскую Молдавскую ССР.

Еще до этого — 22 октября 1990 года — в Дубоссарах состоялся митинг протеста против размещения в районе без согласия местных властей вооруженного отряда на милицейских машинах без номеров. Горсовет по требованиям митингующих заявил протест председателю Верховного Совета Молдавии Мирче Снегуру, после чего сотрудники МВД Молдавии были рассредоточены по пригородным селам. Порядок же в городе стали охранять сформированные отряды народных дружинников.

2 ноября 1990 года в Дубоссарах распространился слух, что кишиневская милиция хочет захватить город. Около 10 часов утра женщины и ветераны начали митинг перед зданием райисполкома. В этот же день министр внутренних дел Молдавии Ион Косташ подписал приказы «О деблокировании Дубоссарского моста через реку Днестр и охране общественного порядка в городе Дубоссары» и «Об организации КПП на транспортных магистралях и дорогах Григориопольского и Дубоссарского районов». Позднее он заявлял, что «приказом было запрещено применение огнестрельного оружия, за исключением случаев, предусмотренных уставом». Жители Дубоссар заблокировали мост через Днестр, но в пять часов вечера отряд ОМОН под командованием начальника кишиневского ГУВД Вырлана начал штурм. Омоновцы сначала стреляли в воздух, потом применили дубинки и слезоточивый газ. К месту происшествия прибыли также 135 курсантов школы милиции и 8 офицеров во главе с подполковником Нейковым. В ходе столкновения на Дубоссарском мосту впервые с начала конфликта было применено оружие. В результате применения оружия сотрудниками ОМОН три человека были убиты, пятнадцать — ранены, из них 9 человек получили пулевые ранения. Уголовные дела, возбужденные по данным фактам, не получили дальнейшего рассмотрения и уже вскоре были закрыты. ОМОН через некоторое время отступил, а вечером того же дня по приказу сепаратистов все въезды в город были блокированы.

Утром того же дня, группой жителей села Варница возле объединения «Бендерытранс», были захвачены 9 дружинников, проводивших патрулирование. Согласно показаниям двух из них, их привели в Варницкий сельсовет, где их избивали и пытались заставить подписать протокол, в котором говорилось, что они пытались сорвать румынский «триколор» в центре села. Около двух часов дня в сельсовет прибыли представители Бендерского городского отдела внутренних дел и увезли дружинников. Вечером интервью с ними было показано на бендерском телевидении. Этот репортаж, а также распространившаяся информация о событиях в Дубоссарах привели к созданию в Бендерах временного комитета по чрезвычайным ситуациям, предпринявшего срочные меры по блокировке въездов в город. Был организован штаб обороны, началась запись добровольцев. Вечером в Бендеры стали поступать сведения, что в каушанском направлении замечены автобусы и машины. Выяснилось, что с юга к городу направляются 120 транспортных единиц. Около полуночи стало известно, что к городу со стороны Кишинева направляется еще одна автоколонна. По бендерскому радио было передано сообщение: «Просим всех мужчин выйти на площадь и помочь защитить город от национал-экстремистов!». Многие откликнулись, и дополнительные силы были переброшены ко въездам в город. Молдавская автоколонна со стороны Каушан повернула в Урсою и расположилась в Гербовецком лесу. В ту ночь столкновения не произошло, однако постепенный отход молдавских отрядов начался лишь во второй половине. 3 ноября В Бендеры поступили сведения, что в Новых Аненах на стадионе был разбит палаточный лагерь, поэтому заслоны на въездах в город и дежурства добровольцев оставались еще и 4 ноября.

Новый виток противостояния последовал после августовских событий 1991 года. 25 августа 1991 года была принята «Декларация о независимости Приднестровской Молдавской Советской Социалистической Республики», а 27 августа закон «О декларации независимости» принял парламент Молдовы. Закон объявлял незаконным и не имеющим юридической силы пакт Молотова-Риббентропа, особо подчеркивая, что «не спросив население Бессарабии, севера Буковины и области Херца, насильственно захваченных 28 июня 1940 года, а также населения Молдавской АССР (Заднестровья), образованной 12 октября 1924 года, Верховный Совет СССР, в нарушение своих конституционных полномочий, принял 2 августа 1940 года закон «Об образовании союзной Молдавской ССР». Также в законе о независимости подтверждалось «равноправие народов и их право на самоопределение согласно Хартии ООН, Хельсинкскому заключительному акту и нормам международного права». Закон не предоставлял Приднестровью право на самоопределение, так как «издавна населенное молдаванами Заднестровье является составной частью исторической и этнической территории нашего народа». Кроме того, от правительства СССР было потребовано прекратить «незаконное состояние оккупации и вывести советские войска с национальной территории Республики Молдова».

5 ноября 1991 года ПМССР была переименована в Приднестровскую Молдавскую Республику.

Тем временем отношения между Кишиневом и Тирасполем обострялись. Произошел ряд мелких столкновений, одно из которых в первые дни весны 1992 года и послужило поводом для начала крупномасштабных боевых действий.