Настоятель монастыря, отец Пахомий, назначил ему в духовники старца Иосифа. Под его руководством Прохор проходил многие послушания: был келейником старца, трудился в хлебне, просфорне и столярне, нес обязанности пономаря.

В 1780 году его постигла тяжелая болезнь — водянка, и он лежал в безнадежном состоянии. Игумен хотел послать за врачом, но больной повернулся к нему и сказал: «Я поручил себя истинному Врачу душ и телес — Господу и Его пречистой Матери. Если же любовь ваша рассудит, снабдите меня, убогого, Господа ради, небесным врачевством». После этого он исповедался и причастился святых Христовых Тайн. Много лет спустя, незадолго до своей смерти, рассказывал преподобный Серафим одному монаху, какое видение он получил после этого причастия. Пресвятая Дева Мария явилась ему в небесном свете; слева и справа от Нее стояли апостолы Петр и Иоанн. Божия Матерь повернулась к апостолу Иоанну и сказала: «Сей от рода нашего». При этом Она положила Свою десницу на его голову, а жезлом, который держала в левой руке, коснулась больного и тотчас из образовавшегося углубления на его правом боку начала вытекать вода, переполнявшая тело. Шрам от раны остался на всю жизнь.

Когда прошли первые восемь лет послушания, Прохор был пострижен в монахи и вскоре посвящен в иеродиакона. Игумен Пахомий, знавший о его пламенеющей вере, дал ему при постриге имя Серафим.

После посвящения в сан диакона преподобный почти каждый день участвовал в совершении Божественной службы. Оставшееся время он проводил в келье, стоя читал Священное Писание и святых отцов.

В это время ему было еще одно видение. За литургией Великого четверга, которую совершал игумен Пахомий, преподобный Серафим, как диакон, вышел на амвон и возгласил: «Господи, спаси благочестивыя и услыши ны!» При этом он должен был, по уставу, навести орарем на присутствующих. Но вдруг выражение лица его изменилось, он был не в состоянии произнести ни слова. Все поняли, что он имел видение. Два иеродиакона взяли его под руки и ввели в алтарь.

Три часа отец Серафим был не в состоянии что-либо сказать. Когда речь вернулась к нему, он смиренно сообщил игумену: «После малого входа и паремий возгласил я, убогий, в царских вратах: „Господи, спаси благочестивыя и услыши ны“, — и навел на предстоящих орарем и возгласил: „И во веки веков“ — вдруг озарил меня луч как бы солнечного света. Взглянув на сияние, я увидел Господа Бога нашего Иисуса Христа во образе Сына Человеческого, в славе, сияющего неизреченным светом и окруженного, как бы роем пчелиным, небесными силами: ангелами, архангелами, херувимами и серафимами. От западных церковных врат Он шел по воздуху, остановился против амвона и, воздвигши Свои руки, благословил служащих и молящихся. Затем Он, вступив в местный образ Свой, что близ царских врат, преобразился… Я же, земля и пепел, сретая тогда Господа Иисуса Христа на воздухе, удостоился особенного от Него благословения. Сердце мое возрадовалось тогда чисто, просвещенно, в сладости любви ко Господу».

Епархиальный епископ Феофил, сам требовательный монах, зная о смиренном житии молодого монаха и заботясь о пользе церковной, посвятил его 2 сентября 1793 года во иеромонаха. Облеченный благодатью священства, преподобный Серафим продолжал прежнее аскетическое житие. После смерти престарелого игумена Пахомия преподобный Серафим решил перейти к отшельничеству, вне монастыря. В холодное зимнее утро в конце 1794 года преподобный Серафим оставил обитель и с трудом, через высокие снега, лесом пошел к маленькой хижине. Он ничего с собой не взял, кроме Евангелия и священных сосудов для литургии.

Отшельник был одет в белый балахончик; на ногах лапти и старая камилавка на голове. На груди носил он крест — благословение матери, а на спине мешок с камнями и Евангелием. На груди под рубахой он носил, кроме того, несколько железных крестов, которые вместе весили около двадцати фунтов, а на спине такие же кресты весом около восьми фунтов. Он был препоясан железным поясом. Зимою рубил он дрова в лесу для своей печки, но топил ее так, что келья едва нагревалась. Летом разводил огород, от плодов которого питался.

Занимаясь работой, преподобный Серафим молился, пел псалмы и тропари, которые знал наизусть. Особенно любил он догматик 1-го гласа «Всемирную славу» — песнь, прославляющую Пресвятую Богородицу, и антифон 1-го гласа «Пустынным непрестанное Божественное желание бывает, мира сущим суетнаго кроме». Ежедневно он прочитывал несколько глав из Евангелия и Посланий, а также аскетические писания святых отцов, просиявших в отшельничестве.

Но основным его занятием оставалась молитва.

На первой неделе Великого поста преподобный не вкушал никакой пищи; только по воскресеньям принимал он святое причастие и ел просфоры. Два года во время своего отшельничества он питался только одним растением, сниткой, летом — свежей, зимою — сушеной и сваренной в воде.

Иногда он рассказывал другим старцам о бесовских искушениях, которые посещали его среди ночи, когда он молился. Ему казалось, что стены хижины исчезали и дикие звери с рычанием нападали на него.

Когда таким способом не удалось изгнать подвижника из уединения, враг напал на него через злых людей. Осенним днем 1801 года преподобный рубил дрова в лесу. К нему подошли трое мужчин в крестьянской одежде и начали требовать от него денег. Они думали, что он много получает от приходящих к нему. Отец Серафим ответил, что у него ничего нет. Несмотря на то, что в руках преподобный Серафим держал топор и был достаточно силен, чтобы защититься, но он решил не сопротивляться и опустил топор на землю. Тогда один из пришедших ударил его обухом по голове. У старца полилась кровь изо рта и ушей, он упал. Избив старца и обыскав хижину, грабители ушли, ничего не найдя. До глубокой ночи лежал старец без сознания на земле. Рано утром он появился в монастыре, весь в крови. Через восемь дней, не видя улучшения, игумен послал за врачами. Пока они совещались, больной заснул. Во сне ему было снова видение Божией Матери и апостолов Петра и Иоанна. Небесная Царица повернулась к врачам и сказала: «Что вы трудитесь?» А потом обратилась к апостолам, сказав: «Сей от рода нашего!» И в это мгновение больной пробудился.

Он решительно отказался воспользоваться помощью врачей и сказал, что хочет отдать себя в руки Божии и Пресвятой Богородицы. Через четыре часа он почувствовал облегчение, поднялся и вкусил немного хлеба. Но избиение не прошло бесследно: подвижник навсегда остался сгорбленным и мог ходить, опираясь на посох.

Через пять месяцев старец вернулся в свою отшельническую келью. Прощаясь с игуменом, он просил, чтобы преступников не наказывали, иначе он навсегда покинет Саров.

Спустя год умер игумен монастыря. Братия просили преподобного Серафима принять игуменство. Но преподобный отклонил это избрание и наложил на себя новый аскетический подвиг — молчание.

Три года жил старец в совершенном молчании. Он ни с кем не говорил, даже с монахом, приносившим ему хлеб. Когда в лесу кто-нибудь к нему приближался, он падал ниц на землю.

Молчание, однако, было только ступенью к еще более высокому аскетическому подвигу. Вечером 8 мая 1810 года Серафим снова появился в обители и стоял за вечерним богослужением. На другой день — это был день святителя Николая Чудотворца — старец пришел к ранней литургии, причастился святых Христовых Тайн и получил благословение игумена. После этого он вернулся в свою монастырскую келью и там затворился. Так начал Серафим новый аскетический подвиг — затворничество.

Сперва он спал только в сидячем положении на деревянном полене. Позже — в сделанном своими руками гробе, который постоянно должен был напоминать ему о смерти. Тело его, как и прежде, было отягощено веригами; для того чтобы больше себя утомить, он перетаскивал дрова с одной стороны кельи на другую. Стоя или на коленях преподобный молился умом в сердце; часто читал он вслух Священное Писание: каждый день по евангелисту, апостольское Послание и Деяния святых апостолов. По воскресным и праздничным дням он причащался святых Христовых Тайн, которые ему по благословению игумена подавались через окошечко в двери после ранней литургии. Он никого не принимал. Когда епархиальный архиерей, обозревая Саровскую обитель, пришел к его келье, двери ее остались закрытыми и для него.