12 сентября 1838 года Герман окончил гимназию, и встал вопрос о выборе карьеры. Из наук его более всего привлекало естествознание. Однако отсутствие необходимых средств для того, чтобы посвятить себя чистой науке, заставило отца Германа отсоветовать сыну идти на естественный факультет, и Герман решился посвятить себя изучению медицины как области, которая может помочь ему так устроиться в будущем, чтобы не прерывать своих занятий физикой и математикой. К этому присоединилось еще одно благоприятное обстоятельство, которое и решило все дело; единственным родственником, причастным к науке в семье Гельмгольца, был Муренин, занимавший видную должность. Он взялся похлопотать, чтобы Германа приняли на государственный счет в Военный Медико-хирургический институт Фридриха-Вильгельма в Берлине, который готовил военных врачей.
Семнадцатилетний студент в первом семестре изучает физику, химию и анатомию. Кроме этих главных предметов, он за первый год прослушал логику, историю, латинский и французский языки. Свободное время в течение каникул и праздников Герман посвящал чтению Гомера, Байрона, Био и Канта. Герману повезло не только с сокурсниками (с ним училась целая плеяда будущих корифеев физиологии, составившая цвет немецкой науки: Карл Людвиг, Дюбуа-Реймон, Брюкке, Вирхов, Шванн), но и с преподавателем физиологии Иоганнесом Мюллером, светилом немецкой физиологической науки. Во втором семестре под влиянием своего знаменитого учителя Герман заинтересовался физиологией и гистологией. Учеников Мюллера объединяло одинаковое стремление связать физику с физиологией и найти для их обоснования более прочный фундамент. Герман значительно превосходил своих друзей в знании математики, которая давала ему возможность точно «формулировать задачи и давать методом их решения правильное направление».
Работа Германа в лаборатории Мюллера, начатая блестяще в студенческие годы и захватившая его, была осенью 1842 года прервана практической работой в качестве хирурга в военном госпитале Шаритэ в Берлине, продолжавшаяся целый год и отнимавшая у него ежедневно время от 7 утра до 8 вечера. Тем не менее 2 ноября 1842 года Герман защитил докторскую диссертацию на латинском языке «О строении нервной системы беспозвоночных». Тему «Строение нервной системы» ему предложил сам Мюллер. В этой диссертации он впервые доказал, что известные элементы нервной ткани, нервные клетки и волокна, соединены друг с другом и составляют части неразрывного целого, получившего в дальнейшем название нейрона.
Чрезвычайно трогательна история, как Герман приобрел микроскоп, при помощи которого он выполнил диссертационную работу. Заболев тифом, он как студент института Фридриха-Вильгельма был бесплатно помещен в больницу Шаритэ, и благодаря этому у него накопилась маленькая сумма от стипендии, что дало ему возможность приобрести микроскоп, правда плохонький.
По окончании института Гельмгольц направляется в больницу Шаритэ ординатором, там же работал Вирхов. Одновременно он трудится в домашней лаборатории Густава Магнуса (1802–1870), автора изданий по механике, гидродинамике, теплоте и т. п. Гельмгольцу предстояла семилетняя отработка стипендии в качестве военного врача. Ему удалось устроиться в Потсдаме, недалеко от Берлина: в октябре 1843 года он служил эскадронным хирургом королевского лейб-гвардии гусарского полка. Живет Гельмгольц в казарме, встает, как все, в пять часов утра по сигналу кавалерийской трубы. Несмотря на все неудобства казарменного быта, он умудряется устроить маленькую физико-физиологическую лабораторию и в 1845 году произвести свои опыты относительно расхода веществ при мышечной работе, для чего Дюбуа-Реймон передал ему портативные весы.
В этом же году физики и химики, работавшие в лаборатории Магнуса, образовали физическое общество, куда приняли молодого Гельмгольца. В июле того же года Гельмгольц сделал составивший эпоху доклад в физическом обществе «О сохранении силы». Он пытался опубликовать эту гениальную работу в научном журнале, но ее не оценили, тогда он издал ее в 1847 году отдельной книгой. Итак, Гельмгольц математически обосновал провозглашенный еще в XVIII веке Ломоносовым закон сохранения энергии, показав его всеобщий характер, и применил этот закон в физиологии. Он объединил этой работой физические, химические и биологические науки, которым принцип сохранения энергии дал прочную основу и положил основание всемирной известности Гельмгольца. Первым, кто еще в 1842 году правильно понял и сформулировал этот закон, был немецкий врач Юлий Роберт Майер из Гейльбронне.
1 июня 1847 года Гельмгольц был переведен в королевский полк Gardes-du-Corps, находившийся также в Потсдаме. Гельмгольц познакомился с семейством Фельтон, глава которого был военным врачом. Молодая Ольга фон Фельтон, с которой Гельмгольц часто играл на рояле, читал стихи и участвовал в спектаклях, произвела на него неизгладимое впечатление, и 11 марта 1847 года он был с ней обручен. 30 сентября 1848 года, прослужив 6 лет военным врачом, Гельмгольц был произведен в старшие врачи. Александр Гумбольт помог Гельмгольцу освободиться от оставшихся трех лет обязательной службы и содействовал его назначению на место Брюкке в Академию художеств и анатомо-зоологический музей. Академия и Мюллер были этим очень довольны. Но едва лишь Гельмгольц освоился в новых условиях, как уже в следующем году его ожидало новое назначение.
Профессора Брюкке перевели на кафедру физиологии в Кёнигсбергский университет, и ему потребовался заместитель. Это мог быть или опытный Дюбуа-Реймон, или Гельмгольц. Но так как Дюбуа-Реймона, пока он занимался научной работой, отец еще мог содержать, то выбор пал на его друга — Гельмгольца. По рекомендации Мюллера Гельмгольца приглашают в 1849 году профессором физиологии в университет Кёнигсберга. В Кёнигсберге в процессе своих исследований он сконструировал ряд оригинальных измерительных приборов. Большое распространение в разнообразных областях физиологического исследования и медицины получили сконструированные им глазное зеркало (офтальмоскоп), который дал возможность наблюдать глазное дно, и так называемый маятник Гельмгольца, позволяющий подвергать ткань быстро следующим друг за другом раздражениям с точной дозировкой времени. И в настоящее время офтальмоскоп играет огромную роль при диагностике не только глазных болезней, но и нервных заболеваний, таких как опухоли мозга, сухотка спинного мозга и т. д.
Кёнигсбергский период научной деятельности Гельмгольца был наиболее продуктивным. Там же он развил физиологическую теорию слуха, по которой в основе способности животных и человека различать один звуковой тон от другого лежит явление резонанса. Звук определенной высоты приводит в колебательное движение не всю основную звуковую мембрану, а только какую-нибудь одну группу ее волокон, резонирующих на данную звуковую частоту. На основе физических законов резонанса Гельмгольцем создано учение о слуховой функции кортиева органа, находящегося во внутреннем ухе человека.
Труды Гельмгольца в области физиологии посвящены изучению нервной и мышечной систем. Он обнаружил и измерил теплообразование в мышце термоэлектрическим методом (1845–1847) и, пользуясь им же разработанной графической методикой, детально изучил процесс мышечного сокращения (1850–1854) в опытах на лягушке; гальванометрическое измерение малых интервалов времени (по баллистическому принципу). Тогда Гельмгольц задался этой целью, его учитель, Мюллер, засомневался в возможности измерить скорость прохождения возбуждения по нерву, то почти неизмеримо малое количество времени, когда человек почувствовал боль от ожога. За этот ничтожный промежуток времени возбуждение должно проделать известный путь по нервным проводникам. Как же измерить скорость передвижения возбуждений по нервам? Да и возможно ли это? Будучи искуснейшим из экспериментов, Гельмгольц взялся за разрешение этой задачи, предложив гениальное по простоте решение.
Он подводил электрический ток к нерву лягушки у какой-либо ее мышцы. Ток возбуждал нерв, мышца отвечала на это раздражение сокращением. Затем он раздражал электрическим током тот же нерв не у самой мышцы, а на некотором расстоянии от нее. Мышца снова сокращалась, но несколько позднее, чем в первый раз. Эта разность во времени, разделенная на длину участка нерва между двумя точками, где прикладывалось электричество, показывала скорость, с которой раздражение прошло по нерву. У лягушки, на которой был проведен Гельмгольцем этот эксперимент, скорость распространения возбуждения по нервам оказалось равной 27 метрам в секунду. Как отличалась эта сравнительно небольшая скорость от той фантастической цифры, которую называли ученые! Предполагали, что скорость движения возбуждения по нервам равна скорости света — 300 тысяч километров в секунду!