Для успешного тестирования вирусов необходимо создать стандартные условия, использовать высококачественные антитела, ферменты, плата.
Материалы и оборудование. Полистероловые плата, растительные вытяжки, гомогенизатор, сыворотки, растворы ферментов, кровь млекопитающих, буферный раствор, центрифуга, растительный материал.
Ход работы.
1. Растительный материал гомогенизируют и центрифугируют.
2. Заполнить сывороткой полистероловые плата и оставить для инкубации на 6 часов.
3. Промыть плата буфером.
4. Внести в лунки плата центрифугат и оставить для инкубации на 1 час.
5. Промыть плата буфером.
6. Заполнить плата сывороткой с ферментом и оставить на 1 час.
7. Промыть плата буфером.
8. Внести в лунки субстрат для фермента.
9. Протестировать изменение окраски в лунках плата по шкале.
10. Отобрать образцы без вирусов, со слабой степенью заражения и с сильным заражением вирусом.
11. Результаты тестирования зарисовать, сделать выводы о качестве посадочного материала.
Работа 6. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ТЕРМОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ
Объяснение. В случае заражения посадочного материала вирусами применяют термотерапию. Предварительно клубни без бактериальных и грибковых инфекций тестируют ИФА. Затем их размещают в кюветах со стерильным песком и проращивают 1–2 недели при температуре 28–30 °C, 4 недели при температуре 37–38 °C и влажности воздуха 70–80 %. Дважды в день песок увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа и микроэлементов по прописи Мурасиге-Скуга: 5 мл маточного раствора на 1 л раствора Кнопа. Клубни жаровыносливых сортов можно сразу выращивать при температуре 37–38 °C и влажности воздуха 70 %.
Режим тепловой обработки для каждого сорта подбирают экспериментально.
В случаях заражения растений мозаичными, веретеновидными, нитевидными, палочковидными вирусами термическая обработка малоэффективна. Поэтому дополнительно используют биотехнологические методы: метод апикальных меристем. Для этого перед термообработкой верхушки растений картофеля срезают и помещают на 5 часов в раствор гетероауксина (50 мг/л). Укорененные проростки помещают в культуральные камеры или комнату с температурой воздуха 37 °C, почвы — 30–32 °C, с фотопериодом 16 часов на 4–6 недель.
Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на питательные среды (МС без гормонов, pH 5,7).
Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями, ламинарбокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином, спиртовки, пробирки с питательными средами.
Ход работы.
1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.
2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), про мыть проавтоклавированной водой.
3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см) и поместить в кюветы для проращивания и термотерапии.
4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами.
6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗВИРУСНОГ0 ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.
Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.
РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10–35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30–40 % больше образуется растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.
Ход работы.
1. Раствор РНК-аЗы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до 0,5 см.
2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.
3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.
4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).
5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.
6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.
ТЕМА III. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА.
Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает кал лус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для растения in vivo каллус — это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.
Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют оп ределенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.
На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.
В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки-антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро- и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли.
Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематическои активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.
В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).
