Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4 °C; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты — при -20 °C в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10–40 раз, микросолей — в 100-1000 раз, витаминов — в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли — раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА — трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны — это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5–2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5–1 н НСl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.
Ход работы.
1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до
200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
4. Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5–6,0 добавить несколько капель 0,1 н НСl, если ниже этого значения — 0,1 н КОН.
5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы.
6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).
7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.
Работа 3. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.
Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5–2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15–20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном — газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.
Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1–2 атмосферы и температурой 120 °C в течении 20–60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.
Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы.
Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170–250 °C в течении 1–2 часов.
Материалы и оборудование. Чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.
Ход работы.
1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при t° 170–200 °C в течение 2 часов.
2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав.
3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1–0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.
4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1–1,2 атм.
5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.
6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.
Работа 4. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ
Объяснение. С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.
Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов — кору, с почек — кроющие чешуи.
Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Na, сулемой), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.
Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5–7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5–8 минут.
Гипохлорит натрия используется в виде 0,5–5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2–3 % раствор в течение 10–15 минут, а для сухих семян 3–5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н НСl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.
Хлорамин применяют в концентрации 1–6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1–3 минут, сухие семена — 30–60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2–3 раза.
Сулема — токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1–3 минут, для корне- и клубнеплодов — до 10–20 минут.
