При подготовительной работе, связанной с установкой капилляров, отрезанных самостоятельно, необходимо контролировать место среза. Только ровное место среза гарантирует безупречный ввод пробы.
Для изготовления окна для детектирования имеются две возможности: во-первых, полиимид может выжигаться, во-вторых он может удаляться с помощью концентрированной кислоты (время обработки около 1 часа). Выжигание можно осуществить просто нагретой до красного каления проволокой. Этот метод однако не следует применять для капилляров, модифицированных покрытием внутри.
Соскабливание (лезвием бритвы) полиимида довольно трудно, и при этом можно разбить капилляр.
Модификация поверхности капилляра может достигаться теми же методами, которые описаны для модификации силикагеля с целью получения стационарной фазы для ВЭЖХ или для покрытия капиллярных колонок в ГХ. Как уже отмечалось ранее, для характеристики модифицированной поверхности капилляра применяется в основном изменение ЭОП. Иногда применяется также газохроматографический метод.
Преимущества и недостатки модифицированных капилляров обсуждаются в конкретных методиках разделения, в которых используются эти капилляры. То же самое относится к капиллярам, заполненным гелем.
В КЭ типичный вводимый объем находится в пределах между 2 и 20 нл, так что при объеме пробы 1 мкл возможно многократное впрыскивание. Раствор пробы после анализа с помощью КЭ может использоваться для дальнейших исследований. В таблице 6 представлены вводимые объемы вместе с другими важными характеристиками системы разделения. Объем рассчитывался для введенной зоны пробы длиной 1 мм в капилляре с внутренним диаметром от 250 до 25 мкм. Вводимый объем в используемых капиллярах с внутренним диаметром 75 мкм составляет около 5 нл, что соответствует от 0.5 до 2 ppm от объема пробы 1 мкл.
Помимо вводимого объема, важным параметром разделительной системы является также сопротивление капилляра. Эта характеристика была занесена в табл. 6 как отношение сопротивления данного капилляра к сопротивлению капилляра с внутренним диаметром 100 мкм. Из таблицы также видно, что сопротивление при уменьшении внутреннего диаметра от 100 мкм до 50 мкм падает до 25 % от первоначального значения. Это означает, что при идентичных экспериментальных условиях джоулево тепло уменьшается на четверть. Поскольку удваивается также отношение поверхности к объему, возникающее тепло будет легче отводиться. Вот почему для разделения выгодно использовать узкие капилляры. Однако имеются также и два осложняющих обстоятельства: во-первых, при этом уменьшается толщина слоя при УФ-детектировании в режиме реального времени и поэтому снижается чувствительность детектирования, во-вторых, возрастает время, необходимое для обновления разделительного буфера.
Времена относятся к буферной системе с вязкостью воды, капилляру длиной 1 м и разнице давлений около 0.5 бар. Причина сильного увеличения времени промывки заключается в зависимости потока от внутреннего диаметра капилляра, которая формулируется законом Хагена-Пуазейля:
dV/dt = π∙Δp∙r4∙t/8∙η∙L
В таблице 7 приведены времена, которые необходимы для промывки капилляра определенным объемом (колонка 2) или объемом, в несколько раз превышающим объем капилляра (колонка 3). Времена, рассчитанные в этой таблице, дают также представление о зависимости времени ввода при вводе зон пробы одинаковой длины и, соответственно, одинаковых объемов в капиллярах с различным внутренним диаметром. Если, например, мы будем вводить в капилляр диаметром 50 мкм такой же объем пробы, как в капилляр диаметром 100 мкм, то время ввода будет в 16 раз больше. Если же будем вводить зоны пробы одинаковой длины, необходимо по крайней мере еще 4-х кратное время ввода.
6.3. Ввод пробы
Воспроизводимый ввод пробы представляет в КЭ наиболее сложную проблему. Для того, чтобы не вызвать уширения полос, зона пробы должна быть мала. Поэтому необходимо вводить очень маленький объем пробы — от 5 до 50 нл. Слишком большой объем пробы очень быстро приводит к искажению пика и ухудшению разделения. Чтобы отвечать этим высоким требованиям, а также для облегчения работы со столь малыми объемами, необходима миниатюризация и автоматизация ввода пробы.
Воспроизводимый ввод маленьких объемов пробы является важной предпосылкой для количественного анализа и стандартизации отклонений. Важнейшие способы ввода пробы, которые находят применение в различных автоматизированных коммерческих приборах, представлены в табл. 8.
6.3.1. Ввод пробы давлением
Ввод пробы обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуда для пробы, либо снижается на конце капилляра. Обе эти возможности допускают также простую промывку капилляра свежим буферным раствором. Количество вводимой пробы рассчитывается по соотношению:
Q = Δp∙π∙r4∙ti∙c/8∙η∙L
и зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы. При временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар. В коммерческих приборах это наиболее распространенный способ ввода проб.
Проблему при этом методе ввода пробы составляет сжимаемость газа. Схема на рис. 19 поясняет эту проблему. Во-первых, выбранное для ввода давление должно быстро достигаться, во-вторых, падение давления после ввода пробы не должно быть резким. Поэтому полезно использовать в работе интеграл давление-время.
Рис. 19. Кривая давление-время при вводе проб:
а) неконтролируемое повышение давления (например, в результате простого открывайся вентиля давления);
Ь) контролируемое повышение и понижение давления. Затемненная площадь — нормальный интеграл давление-время, заштрихованная площадь — коррекция посредством дополнительного импульса давления.
Относительное стандартное отклонение, по нашим оценкам, лежит в интервале между 2 % и 3 %; применяя внутренний стандарт можно уменьшить эту величину до 1 % и ниже.
Для определения вводимого объема существуют две принципиальные возможности. Во-первых, это удается сделать с помощью расчета, во-вторых, его легко можно контролировать посредством измерения. Расчет вводимого объема базируется на законе Хагена-Пуазейля и сильно зависит от параметров, которые обычно известны. В качестве примера можно назвать вязкость, а также радиус капилляра. Колебание радиуса капилляра только на 1 % вызывает очень большую ошибку в расчетах, поскольку в законе Хагена-Пуаэейля радиус входит в четвертой степени.
Практическое определение осуществляется очень просто измерением проскока: время ввода выбирается так, чтобы зона пробы УФ-активного раствора доходила до детектора. Полученный ступенчатый сигнал анализируется таким образом, что отыскивается точка сигнала на половине высоты, и перпендикуляр на ось времени дает время проскока растворителя. Поскольку в данном случае можно работать с таким же растворителем, который вводится в систему, ошибка, связанная с вязкостью или радиусом капилляра, может быть незначительной. Расчет вводимого объема проводится теперь просто через время. Например, известно, что поток перемещается на 17.7 мм в минуту. При времени ввода 30 секунд (типично для анализа ионов в КЭ) и длине вводимой зоны пробы 8.9 мм это соответствует количеству почти 40 нл (при внутреннем диаметре 75 мкм).
