Методы анализа на основе моноклональных антител
Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.
Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.
В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:
Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую)
метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.
Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта:
А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:
Б. Система "биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин":
В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.
Применение антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему "приклеятся" специфические антитела, а к ним уже — меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде.
Кроме красителя в качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.
Радиоактивные метки.
Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизотопные метки (радиоиммунный анализ — РИА), предложенные американскими исследователями (С. А. Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных трудностей, связанных с применением изотопных маркеров. Так, изотоп 125I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп 3Н имеет длительное время жизни (12.5 лет), однако под антитело + биотин действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3Н-соединений тоже ограничено. Кроме того, эффективность счета трития существенно ниже, чем 125I. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.
При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10-12 г/литр.
В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако, только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.
Для введения ферментативной метки разработано много разных химических, биохимических и иммунологических способов.
Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.
Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако, к некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.
Один из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело — фермент (рис. 19,а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.
Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело — фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.
Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.
