Четвертый этап — слияние мембран. Благодаря мостикам, образуемым Са2+, размер мицелл уменьшается. Под действием АТФ и Са2+, активизируются микрофиламенты. Возникший цитоплазматический мостик стабилизируется и расширяется благодаря функционированию микрофиламентов. На последних этапах слияния клеток важную роль играет наличие АТФ. АТФ образуется благодаря деятельности митохондрий. Поликарионы, образующиеся при слиянии двух или трех клеток, представляют собой не бесформенные раздутые или двулопастные шары цитоплазмы, а принимают форму, характерную для одной из родительских клеток или промежуточную между ними. Форму клетки определяют микротрубочки и микрофиламенты. В процессе слияния клеток микрофиламенты актиномиозинового типа, расположенные под цитоплазматической мембраной, принимают непосредственное участие, так как обеспечивают объединение цитоплазм слившихся клеток и стабилизацию вновь образованной системы. Однако, формирование цитоскелета — энергозависимый процесс, требующий большого количества АТФ. Видимо, этим обусловлено присутствие митохондрий в местах слияния клеточных мембран.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА
Функциональная структура антител
Слияние клеток лежит в основе получения гибридных клеток, продуцирующих антитела. Антитела — белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. В совокупности называемые иммуноглобулинами (Ig), антитела составляют один из главных белковых компонентов крови — по весу около 20 % суммарного белка плазмы.
В качестве антигенов выступают различные вещества: клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, в некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получивших название антигенных детерминант. В случае белковой молекулы антигенном детерминантом являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков.
Простейшие молекулы антител имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками — по одному на конце каждой из двух "ветвей". Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены:
Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок:
Тенденция больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) удобна для выявления антител и антигенов. Образование таких комплексов может приводить к агглютинации (склеиванию) молекул. Это явление лежит в основе определения групп крови, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности — реакция гемагглютинации.
Молекула антитела образована четырьмя полипептидными цепями (рис. 33).
Рис. 33. Строение антитела
Две из них — идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две — тяжелые (Н-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидами) связями. Антиген-связывающие участки образуются за счет одной Н и одной L-цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на Н-цепи. Н-цепь образует также "хвостовой" участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами.
Получение моноклональных антител
Как образуются антитела? Иммунный ответ — сложный процесс межклеточных взаимодействий различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.
Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.
Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген — антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами неприемлим.
Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов — гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
Животное иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.
Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА — антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.
Другой метод получения антител основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток.
