Рис. 30. Модифицированный метод Троувелла

_{(по И. Ласнитски, 1989)}

В 1976 году, для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и др. был предложен метод поочередного культивирования в жидкой среде и газовой фазе. Для этого экспланты прикрепляются ко дну пластикового сосуда и покрываются средой. Сосуды помещают в камеру с определенным газовым составом, а камера помещается на качающуюся платформу.

ГИБРИДИЗАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

История метода

Предположение о том, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, было высказано еще в начале XIX века в связи с открытие многоядерных клеток. В историческом аспекте представляет интерес то обстоятельство, что открытие поликарионов как бы подтверждало ошибочное представление Шлейдена, который считал, что новые клетки зарождаются в виде пузырьков внутри цитоплазматической мембраны родительских клеток. Разделявший эту точку зрения Рудольф Вир хов представил в 1851 г. рисунок многоядерной опухолевой клетки в полной уверенности, что ядра являются эндогенными зачатками новых клеток. Кроме того, открытие поликарионов подлило масла в огонь борьбы с клеточной теорией. Противники ее выдвинули гипотезу, согласно которой организм представляет собой единую тканевую массу с непрерывной цитоплазмой, а существование поликарионов рассматривали как подтверждение этой гипотезы. Со временем восторжествовала клеточная теория, а существование поликарионов отнесли к разряду интересных исключений.

Гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах нашего столетия. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Исходные линии отличались по числу и морфологии хромосом, а также по способности к образованию опухоли при введении их мышам. Гибридные клетки содержали число хромосом, отличное от исходных клеточных линий, а также содержали поверхностные антигены клеток обеих родительских линий. Далее было установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных. В качестве агента, индуцирующего слияние, выступал инактивированный вирус HVJ, называемый также вирусом Сендай. С этих пор вирус Сендай стал широко использоваться в экспериментах по слиянию клеток.

При изучении межвидовых гибридных клеток, способных к пролиферации были сделаны два очень важных наблюдения:

— в гибридах могут проявиться оба генома;

— в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.

Слияние клеток не обязательно должно быть чем-то стимулировано. Как in vivo, так и in vitro оно может проходить и без добавления специальных агентов. Несмотря на то, что все слияния такого рода можно считать спонтанными, некоторые из них постоянно происходят в процессе онтогенеза, а следовательно, эволюционно запрограммированы. До сих пор нерешенной остается одна из труднейших загадок биологии, состоящая в том, что мембраны, находящиеся внутри клетки сливаются часто, тогда как мембраны, разграничивающие клетки, сливаются редко. Например, пузырьки аппарата Гольджи сливаются друг с другом, образуя клеточные пластинки при цитокинезе у растений, мембраны ЭР — с элементами АГ при переносе вновь синтезированных белков и т. д.

В то же время нормальные клетки в естественных условиях крайне редко сливаются друг с другом. Исключение составляет процесс оплодотворения. Кроме того, в качестве подобного рода исключения выступает процесс плазмогамии у высших грибов, когда одноядерные гаплоидные клетки сливаются, образуя двуядерные (дикарионы). Такие клетки размножаются митотически, оставаясь двуядерными, и в результате образуют всем хорошо известные плодовые тела.

В естественных условиях слияние клеток происходит и у млекопитающих. Например, клетки могут сливаться при формировании мышечных трубочек. Еще в XIX веке было показано, что миофибриллы поперечно-полосатых мышц образуются в поликарионах — крупных удлиненных многоядерных клетках. Поликарионы — продукт слияния одноядерных миобластов. Слияние опухолевых клеток — довольно обычное явление, при этом опухолевые клетки in vivo иногда сливаются и с нормальными. Эксперименты по спонтанному слиянию клеток проводились и in vitro. При проведении подобных экспериментов получают так называемых "химерных" или аллофеных мышей — животных, в тканях которых содержатся клетки различных генотипов (рис. 31).

Рис. 31. Получение аллофенных мышей

Методы создания химер

1. Агрегационный — был предложен практически одновременно и независимо друг от друга Тарковским в Варшаве и Минц в Филадельфии (1961–1962 гг.).

Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т. е. состоят из "белых" и "черных" клеток.

Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода — не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

2. Инъекционный — был разработан Р. Гарднером в 1968 г.

Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона — рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.

Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: М. muskulus и М. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту М. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона М. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку М. muskulus и благополучно развивались там, а в организме М. caroli погибали спустя две недели.

Межвидовые химерные зародыши между мышью и крысой путем агрегации были получены только в 70-х годах. Первые химерные животные были получены только в 1973 году Р. Гарднером и М. Джонсоном. Успех этих экспериментов позволил приступить в 80-х годах к созданию химерных сельскохозяйственных животных. Выяснилось, что агрегационный метод неприемлем для получения химер крупного рогатого скота. Химер телят Bos indicus + Bos taurus удалось получить только инъекционным методом.