Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Широкое использование фибробластов для изучения патогенеза и диагностики наследственных болезней обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой являются фибробласты, составляет значительную часть массы тела. Кроме того, фибробласты составляют строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимого для дифференцировки и функционирования специализированных клеток. В фибробластах имеется фермент моноаминоксидаза, изменения активности которого характерны для некоторых нервных и психических заболеваний. Фибробласты содержат рецепторы к глюкокортикоидным гормонам, инсулину, некоторым нейромедиаторам.

Гринбергом в 1978 году была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo.

Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организмадонора.

Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма.

В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Все вышеперечисленное также способствует использованию фибробластов для изучения клеточных, биохимических, молекулярных аспектов патогенеза ряда болезней, в том числе и связанных с наследственными дефектами нервной системы.

Культивирование клеток и тканей беспозвоночных

Интерес к клеточным культурам беспозвоночных связан с разнообразием и оригинальностью роста и метаморфоза, которые могут быть объектом для изучения основных процессов клеточной дифференцировки и регуляции активности генов. С другой стороны, при рассмотрении способов получения энтомопатогенных препаратов отмечалось, что вирусы могут размножаться только при использовании живых клеток насекомых, в связи с чем, для получения вирусных препаратов необходимым условием являлось предварительное разведение насекомых-хозяев. Использование клеточных культур беспозвоночных позволяет решить эту проблему.

Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьируют по составу. При составлении сред используются данные по составу гемолимфы. Среды отличаются от сред для клеток и тканей млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением.

Для получения культуры клеток и тканей беспозвоночных используют эмбрионы, имагинальные диски и органы насекомых:

— имагинальные диски (зачатки взрослых органов насекомых) используют для изучения процессов дифференцировки in vitro;

— эмбрионы с удаленной оболочкой используют для изучения начальных стадий развития насекомых;

— отдельные органы для различных целей. Например, слюнные железы Diptera для изучения процессов пуффирования в политенных хромосомах (пуф вздутие хромосом при "включении" ДНК на транскрипцию, когда определенные участки ее раскручиваются и РНК-синтезирующие ферменты начинают синтез РНК; при линьке насекомых пуфы появляются в определенной последовательности).

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОРГАНОВ

Органная культура — культивирование in vitro органа или части органа, в которых сохраняются анатомическая связь и функционирование тканей, максимально приближенные к таковым в условиях in vivo, то есть в организме. Миграция изолированных клеток на периферии экспланта подавляется специальными условиями культивирования, в результате чего могут даже образовываться дифференцированные структуры. Например, на периферии эксплантов легочной ткани развиваются новые мелкие бронхи, состоящие из альвеол, окаймленных бронхиальным эпителием.

Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода поддерживает гистологическую и гистохимическую дифференцировку, как правило, остается в не растущем состоянии в течение нескольких дней и даже недель. Эти культуры не способны к размножению.

Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, эндокринные органы продолжают секрецию специфических гормонов и т. д. Наибольшее сходство процессов морфогенеза in vivo и in vitro отмечено для эмбриональных тканей.

Первые исследования в области культивирования органов и тканей относятся к концу прошлого века. Уже в 1897 году немецкий ученый Лёб (B.Loeb) опубликовал данные о культивировании фрагментов печени, почек, щитовидной железы и яичников кролика на небольших кровяных сгустках в культуральных пробирках. Дальнейшие исследования показали, что для предотвращения центральных некрозов в эксплантах пробирки должны быть заполнены кислородом. В результате многочисленных экспериментов было также установлено, что большинство органов или их фрагментов, за исключением кожи, растут на твердом субстрате лучше, чем в жидкой среде.

Что же можно использовать в качестве субстрата? Существует несколько видов техники культивирования органов. В качестве субстрата можно использовать сгусток плазмы. Этот способ был предложен Феллом и Робинсоном и получил название "техника часового стекла", став классической техникой морфогенетического анализа эмбриональных органов (рис. 28).

Рис. 28. Метод часовых стекол

_{(по Феллу и Робинсону, 1929)}

Культивирование проводят во впадине часового стекла на поверхности сгустка, состоящего из плазмы цыпленка и эмбрионального экстракта кур. Часовое стекло помещают в чашку Петри и закрывают сверху влажной ватой или фильтровальной бумагой для предотвращения высыхания. Культивируют в термостате при 37,5 °C. Существуют модификации этого метода, при которых часовое стекло покрывается крышкой, приклеенной воском и другие. Недостатком метода, ограничивающим применение его в биологических исследованиях, является разжижение сгустка в окрестностях экспланта, который в результате оказывается в жидкости. Кроме того, сложный состав среды затрудняет проведение биохимических исследований.

Эти недостатки устраняются при использовании сгустка агара. Такая техника была предложена Спраттом (рис. 29). Метод основан на получении агарового геля 1–4 % концентрации, основу которого составляют забуференные солевые растворы или питательные среды типа 199 с добавлением эмбриональной сыворотки.

Рис. 29. Метод часовых стекол с агаровым сгустком

_{(по Вольффу и Хафену, 1952)}

В середине 20-го века Чен обнаружил, что культуры можно выращивать на бумажных плотиках, плавающих на поверхности жидкости в часовом стекле. С целью улучшения техники позднее бумагу обрабатывали силиконом, комбинировали с миллипоровыми фильтрами, а затем перешли на плотики из ацетата вискозы. Этот материал хорошо растворяется в ацетоне, что облегчает подготовку ткани для гистологического анализа.

Метод культивирования на плотиках не лишен недостатков, основной из них — погружение ткани в среду при затоплении плотика. Решение этой проблемы было предложено Троувеллом, который предложил культивировать органы на поверхности металлической сетки (рис. 30). Сетка представляет собой квадрат размерами 25*25 мм с отогнутыми краями, образующими четыре ножки высотой около 4 мм. Скелетные ткани культивируют непосредственно на сетке, тогда как мягкие вначале эксплантируются на бумагу, а затем помещаются на сетку.