Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 27):

Рис. 27. Замораживание клеток:

_{а) быстрое, б) медленное, поэтапное}

1. От +20 до -28 °C со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35 °C), выдерживают при этой температуре 15 минут.

2. Погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до — 196 °C)

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии — на спиртовой бане (0,5–1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32 °C (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32 °C). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 — +40 °C, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5–1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3-10 % раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.

Замедление роста

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических — маннит в концентрации 3–6 %.

6. Замена СаСL₂ на Са(NО₃)₂ в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Мембраны хлоропластов

Американский ученый М. Кальвин, чьи исследования в области изучения механизма фотосинтеза были отмечены Нобелевской премией, в 1972 году выдвинул идею создания фотоэлемента, в котором в качестве источника электрического тока служили мембраны хлоропластов. Основной компонент таких мембран — хлорофилл, способный при освещении отдавать и принимать электроны. В качестве проводника, контактирующего с хлорофиллом, Кальвин использовал оксид цинка. Мембраны, содержащие хлорофилл, помещали в раствор ферментов, действующих как катализаторы ЭТЦ. На свету происходит фотолиз воды: Н₂O —> Н₂ + ¹/₂ O₂. При освещении этой системы в ней также возникал электрический ток плотностью 0,1 мкА на см². Такой фотоэлемент функционировал недолго, поскольку хлорофилл вскоре терял способность отдавать электроны. Для того чтобы продлить время действия фотоэлемента, был использован дополнительный источник электронов — гидрохинон. В такой системе хлорофилл отдавал не только свои электроны, но и электроны гидрохинона. Полученный таким образом фотоэлемент площадью 10 м² может обладать мощностью 1 кВт.

Японский ученый Фудзио Такахаси для получения электроэнергии использовал хлоропласты из листьев салата. Транзисторный приемник, к которому была присоединена такая солнечная батарейка, успешно работал.

Если из системы убрать проводник и индуцировать образование водорода и кислорода, то система может служить также прототипом фотореактора, при помощи которого энергия Солнца запасается в ценном топливе — водороде.

Преимущества системы:

— наличие избытка субстрата — воды,

— нелимитируемый источник энергии — Солнце,

— продукт (водород) можно хранить, не загрязняя атмосферу,

— продукт имеет высокую теплотворную способность (29 ккал/г) по сравнению с углеводородами (3,5 ккал/г),

— процесс протекает при нормальной температуре без образования промежуточных токсических веществ,

— процесс циклический, так как при окислении продукта образуется субстрат — вода.

Мембраны хлоропластов можно иммобилизовать, закрепляя их в геле.

Получение фотогальванических элементов с использованием бактериальных мембран

Другой механизм превращения энергии существует у галофильных бактерий. Halobacterium halobium используют энергию света, поглощаемую пурпурным пигментом бактериородопсином, находящимся в мембране клеток. Этот белок с необычными свойствами был выделен и описан в 1973 году У. Стохениусом и Д. Остерхельтом. С его помощью бактерии улавливают энергию Солнца. Поглощение света вызывает химические и физические превращения в молекуле пигмента, приводящие к переносу протонов с одной стороны мембраны на другую, при этом создаётся электрохимический градиент. Разность потенциалов может быть использована для генерирования электрического тока.

Бактериородопсин несложно выделить из бактерий. Для этого бактерии помещают в воду, где они переполняются водой^[72] и лопаются. Мембраны, содержащие бактериородопсин, не разрушаются в воде из-за прочной упаковки молекул пигмента, которые образуют белковые кристаллы — так называемые фиолетовые бляшки. В них молекулы бактериородопсина объединены в триады, а триады — в правильные шестиугольники. Бляшки крупные, легко отделяются центрифугированием. После промывания осадка получается паста фиолетового цвета. На 75 % она состоит из бактериородопсина и на 25 % из фосфолипидов, заполняющих промежутки между белковыми молекулами.

Бактериородопсин устойчив к факторам внешней среды: не утрачивает активность при нагревании до 100 °C, хранится в холодильнике годами, устойчив к кислотам и химическим окисляющим агентам. Устойчивы и фосфолипиды фиолетовых бляшек.

H.halobium можно культивировать в водоемах с высокой концентрацией хлористого натрия и других минеральных солей. Из 10 литров бактериальной культуры получают 0,5 грамма мембран, содержащих 100000 молекул пигмента. Бактериородопсин осаждают с помощью катионов кальция или другим способом. Пигмент можно фиксировать на подложках, обладающих физическими и химическими свойствами для транспорта протонов, и создавать на их основе системы, генерирующие электрический ток. При освещении таких систем на мембране обнаруживается электрический потенциал, то есть бактериородопсин функционирует как генератор электрического тока. В лаборатории В. П. Скулачева были созданы фотогальванические элементы для генерирования тока силой 800 мкА. В них применялись мембранные фильтры, пропитанные фосфолипидами с бактериородопсином и хлорофиллом. Такие фильтры, соединенные последовательно, могут служит в качестве электрической батареи.