К числу значимых элементов подкрепления следует отнести кортиколибериновую систему мозга. Приведенные в обзоре данные указывают на вероятное участие рецепторов КРГ в механизмах тревоги и депрессии, которые, как правило, сопровождают течение лекарственной зависимости и являются неотъемлемыми элементами данного заболевания. Кроме того, имеются прямые доказательства участия рецепторов КРГ и всей кортиколибериновой системы в механизмах аддикции, вызываемых психостимуляторами, опиатами, гипноседативными средствами и гваллюциногенами [Sarnyaietal., 2001; Koob, 2003; Bruijnzeel, Gold, 2005].
Неоспорима существенная роль орексиновой и грелиновой системы в механизмах подкрепления. В обзоре обозначены вероятные механизмы работы этих систем, зоны влияния и точки приложения.
Роль каждой из этих систем к настоящему времени становится вполне понятна, однако, если рассматривать ситуацию вцелом, возникает вопрос взаимодействия их между собой. Или же это независимые друг от друга рычаги влияния на процесс развития аддикции? Ответив на эти вопросы мы сможем еще на один шаг приблизиться к пониманию механизмов возникновения зависимости, а значит, к способам воздействия на этот процесс. Именно эти данные и позволили сформулировать цель настоящего исследования.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выбор животных
Опыты выполнены на … крысах самцах Вистар массой 200-220 г, выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова. Температура воздуха поддерживалась в пределах 20-22°C, относительная влажность – 50–70%. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00. Все опыты проведены в осенне-зимний период.
2.2. Вживление электродов и канюль в структуры мозга
Вживление электродов и канюль в мозг крысам проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с использованием стереотаксического прибора фирмы «Medicor», Венгрия. Билатерально в латеральное гипоталамическое ядро вживляли нихромовые монополярные электроды в стеклянной изоляции (диаметр электрода 0,25 мм, длина оголенного кончика 0,25-0,30 мм, его толщина 0,12 мм) по следующим координатам: АР = 2,5 мм назад от брегмы, SD = 2,0 мм латерально от сагиттального шва, Н = 8,4 мм от поверхности черепа (KönigK. P., KlippelA. A., 1963; Дробленков А. В., 2006). Индифферентный электрод из нихромовой проволоки закрепляли на черепе животного. Все электроды коммутировались на микроразъеме, который фиксировался на черепе самотвердеющей пластмассой (рис.1).
Рис. 1. Последовательные этапы проведения операции по вживлению
электродов и микроканюль в мозг крысы
Металлические направляющие канюли из нержавеющей стали диаметром 0,2 мм вживляли униполярно в правый желудочек мозга одновременно с электродами, вводимыми в латеральный гипоталамус, по следующим координатам (рис.2): АР = 0,8 мм назад от брегмы, SD = 1,4 мм латерально от сагитального шва, Н = 3,8 мм от поверхности черепа согласно атласу K. P. König и A. A. Klippel (1963).
А
Б
Рис. 2. Морфологическая картина зон микроинъекций веществ в центральное ядро миндалины (А) и ядро ложа конечной полоски (Б)
Координаты по атласу К. Кёнига и А. Клиппеля (1963). Показаны фронтальные срезы в мм относительно брегмы.
Канюли фиксировали на черепе животного самотвердеющей пластмассой и после операции закрывали специальным колпачком, который временно снимали для введения веществ в структуру мозга.
При внутриструктурном введении веществ в направляющие вставляли металлические микроканюли диаметром 100 мкм, кончик которых был на 0,2 мм длиннее направляющей.
Поведенческие эксперименты начинали не ранее 10 дней после операции. По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию через вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с. (рис.4).
Рис. 4. Фронтальный срез головного мозга крысы.
Стрелкой указана область вживления электрода в латеральный гипоталамус.
2.3. Методы самораздражения мозга у крыс
Для воспроизведения самораздражения мозга у крыс использовали классический вариант изучения самостимуляции мозга в виде педальной самостимуляции в камере Скиннера. Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажимать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздражения мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговыми значениями тока в режиме «фиксированных пачек»– FR1). Для повторного раздражения животное было вынуждено вновь нажимать на педаль. Анализировали частоту и пороги реакции самостимуляции. Фармакологические препараты вводили на 3-й день эксперимента после стабилизации реакции при использовании фиксированного значения силы тока. Частота нажатий регистрировалась автоматически (рис.5).
Рис. 5. Реакция педальной самостимуляции у крыс в камере Скиннера
Два верхних фото демонстрируют нативную методику самостимуляции,
внизу – схематическое изображение методики.
Регистрировали число нажатий на педаль в течение 10 мин эксперимента, затем производили внутриструктурную микроинъекцию препарата и через 15-20 мин повторно регистрировали число нажатий на педаль за 10-минутный интервал времени. В дополнительных сериях экспериментов исследовали порог возникновения реакций нажатия на педаль. После определения значений силы тока, когда наблюдаются первые изменения в поведении животного, производили ступенчатое повышение тока с шагом в 5 мкА. В камере Скиннера подавали ток в навязанном режиме (серии прямоугольных импульсов отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, интервалы между сериями импульсов 0,5 с) нарастающими порциями (primingstimulation) с интервалом 30 с длительностью по 5 с до появления стойких нажатий педали. Процедуру поиска пороговых значений силы тока повторяли 2 раза. Затем повышали силу тока на 10% от пороговых значений, когда наблюдали выраженную реакцию самостимуляции, и снижали ток порциями (шаг 5 мкА длительностью 30 с) до появления отказа от нажатий педали. Процедуру поиска пороговых значений силы тока также повторяли 2 раза. При совпадении значений силы тока, полученных с использованием нарастающего и снижающего режимов, его считали порогом реакции самостимуляции. Затем производили внутриструктурную микроинъекцию препарата, и через 15-20 мин повторно производили поиск порога реакции самостимуляции.
При изучении подкрепляющих свойств электрической стимуляции мозга в ряде случаев использовался свободный режим подкрепления, когда электрическая стимуляция мозга длится все время нажатия педали (Лебедев А. А., Шабанов П. Д., 1992). Использование данного режима предполагает повышенный уровень нагрузки на подкрепляющие механизмы головного мозга и дает возможность выявлять отрицательную эмоциональную составляющую реакции самостимуляции, которая обычно следует после 0,5 секунды начала раздражения и заставляет животное отжимать педаль, как бы избегать ее (Звартау Э. Э., 1988; Вартанян Г. А., Петров Е. С., 1989).
2.4. Условное предпочтение места
Опыты с условной реакцией предпочтения места проводили в прямоугольной двухкамерной экспериментальной установке размером 35*35*30 см, стороны которой различались цветом (темный и светлый) и текстурой пола и были разделены перегородкой с опускающейся и поднимающейся дверцей. В течение первых двух дней эксперимента животных помещали в установку с целью их адаптации. В первый тестовый день регистрировали время нахождения животного в каждом отсеке в течение 10 мин для определения исходного предпочтения. Отсек считался предпочитаемым, если животное проводило в нем больше 50% времени. В последующие 6 дней обусловливания дверцу между отсеками закрывали. В традиционном варианте животные получают через день инъекцию препарата непосредственно перед помещением в исходно непредпочитаемый отсек на 60 мин и инъекцию физиологического раствора перед помещением в исходно предпочитаемый отсек; животные контрольной группы получают только физиологический раствор. В условиях наших опытов в качестве средства инициации предпочтения использовали грелин (или орексин), вводимый внутрижелудочково. Во второй тестовый день дверцы открывали и повторно измеряли время нахождения в каждом из отсеков в течение 10 мин. Животные контрольной группы получали только физиологический раствор.
