10 февраля 1909 года Великая княгиня собрала 17 сестер основанной ею обители, сняла траурное платье, облачилась в монашеское одеяние и сказала: "Я оставлю блестящий мир, где я занимала блестящее положение, но вместе со всеми вами я восхожу в более великий мир - в мир бедных и страдающих".

День в Марфо-Мариинской обители начинался в 6 часов утра. После общего утреннего молитвенного правила. В больничном храме Великая княгиня давала послушания сестрам на предстоящий день. Свободные от послушания оставались в храме, где начиналась Божественная Литургия. Дневная трапеза проходила с чтением "Жития Святых". В 5 часов вечера в церкви служили вечерню с утреней, где присутствовали все свободные от послушания сестры. Под праздники и воскресение совершалось всенощное бдение. В 9 часов вечера в больничном храме читалось вечернее правило, после него все сестры, получив благословение настоятельницы, расходились по кельям. Четыре раза в неделю за вечерней читались акафисты: в воскресенье - Спасителю, в понедельник - архангелу Михаилу и всем Бесплотным Небесным Силам, в среду - святым женам-мироносицам Марфе и Марии и в пятницу - Божьей Матери или Страстям Христовым. В часовне, сооруженной в конце сада, читался Псалтирь по покойникам. Часто ночами молилась там сама настоятельница. Внутренней жизнью сестер руководил замечательный священник и пастырь - духовник обители, протоирей Митрофан Серебрянский. Дважды в неделю он проводил беседы с сестрами. Кроме того, сестры могли ежедневно в определенные часы приходить за советом и наставлением к духовнику или к настоятельнице. Великая княгиня вместе с отцом Митрофаном учила сестер не только медицинским знаниям, но и духовному наставлению опустившихся, заблудших и отчаявшихся людей. Каждое воскресенье после вечерней службы в соборе Покрова Божьей Матери устраивались беседы для народа с общим пением молитв.

Богослужение в обители всегда было великолепным благодаря пастырским достоинствам духовников, приглашаемых настоятельницей. Сюда приходили для совершения богослужений и проповедования лучшие пастыри и проповедники не только Москвы, но и многих отдаленных уголков России. Как пчела собирает нектар со всех цветов, чтобы люди ощутили особый аромат духовности, так и настоятельница собирала лучших пастырей. Обитель, ее храмы и богослужение, вызывали восхищение современников. Этому способствовали не только храмы обители, но и прекрасный парк с оранжереями - в лучших традициях садового искусства XVIII - XIX веков. Это был единый ансамбль, соединявший гармонично внешнюю и внутреннюю красоту.

Великая княгиня совсем не имела высокого мнения о своих качествах ... У нее никогда не было слов "не могу", и никогда ничего не было унылого в жизни Марфо-Мариинской обители. Все было там совершенно как внутри, так и снаружи. И кто бывал там, уносил прекрасное чувство".

В Марфо-Мариинской обители Великая княгиня вела жизнь подвижницы. Спала на деревянной кровати без матраца. Строго соблюдала посты, вкушая только растительную пищу. Утром вставала на молитву, после чего распределяла послушания сестрам, работала в клинике, принимала посетителей, разбирала прошения и письма.

Вечером, - обход больных, заканчивающийся за полночь. Ночью она молилась в молельне или в церкви, ее сон редко продолжался более трех часов. Когда больной метался и нуждался в помощи, она просиживала у его постели до рассвета. В больнице Елизавета Федоровна брала на себя самую ответственную работу: ассистировала при операциях, делала перевязки, находила слова утешения, стремилась облегчить страдания больных. Они говорили, что от Великой княгини исходила целебная сила, которая помогала им переносить боль и соглашаться на тяжелые операции.

В качестве главного средства от недугов настоятельница всегда предлагала исповедь и причастие. Она говорила: "Безнравственно утешать умирающих ложной надеждой на выздоровление, лучше помочь им по-христиански перейти в вечность".

Сестры обители проходили курс обучения медицинским знаниям. Главной их задачей было посещение больных, бедных, брошенных детей, оказание им медицинской, материальной и моральной помощи.

В больнице обители работали лучшие специалисты Москвы, все операции проводились бесплатно. Здесь исцелялись те, от кого отказывались врачи.

Исцеленные пациенты плакали, уходя из Марфо-Мариинской больницы, расставаясь с "Великой матушкой" как они называли настоятельницу. При обители работала воскресная школа для работниц фабрики. Любой желающий мог пользоваться фондами прекрасной библиотеки. Действовала бесплатная столовая для бедных.

Настоятельница Марфо-Мариинской обители считала, что главное все же не больница, а помощь бедным и нуждающимся. Обитель получала до 12000 прошений в год. О чем только ни просили: устроить на лечение, найти работу, присмотреть за детьми, ухаживать за лежачими больными, отправить на учебу за границу.

Она находила возможности для помощи духовенству - давала средства на нужды бедных сельских приходов, которые не могли отремонтировать храм или построить новый. Она ободряла, укрепляла, помогала материально священникам-миссионерам, трудившимся среди язычников крайнего севера или инородцев окраин России.

Одним из главных мест бедности, которому Великая княгиня уделяла особое внимание, был Хитров рынок. Елизавета Федоровна в сопровождении своей келейницы Варвары Яковлевой или сестры обители княжны Марии Оболенской, неутомимо переходя от одного притона к другому, собирала сирот и уговаривала родителей отдать ей на воспитание детей. Все население Хитрова уважало ее, называя "сестрой Елисаветой" или "матушкой". Полиция постоянно предупреждала ее, что не в состоянии гарантировать ей безопасность.

В ответ на это Великая княгиня всегда благодарила полицию за заботу и говорила, что ее жизнь не в их руках, а в руках Божьих. Она старалась спасать детей Хитровки. Ее не пугали нечистоты, брань, потерявший человеческий облик лица обитателей. Она говорила: "Подобие Божье может быть иногда затемнено, но оно никогда не может быть уничтожено".

Мальчиков, вырванных из Хитровки, она устраивала в общежития. Из одной группы таких недавних оборванцев образовалась артель исполнительных посыльных Москвы. Девочек устраивала в закрытые учебные заведения или приюты, где также следили за их здоровьем, духовным и физическим.

Елизавета Федоровна организовала "Дома призрения" для сирот, инвалидов, тяжелобольных, находила время для посещения их, постоянно поддерживала материально, привозила подарки. Рассказывают такой случай: однажды Великая княгиня должна была приехать в приют для маленьких сирот. Все готовились достойно встретить свою благодетельницу. Девочкам сказали, что приедет Великая княгиня: нужно будет поздороваться с ней и поцеловать ручки. Когда Елизавета Федоровна приехала - ее встретили малютки в белых платьицах. Они дружно поздоровались и все протянули свои ручки Великой княгине со словами: "целуйте ручки". Воспитательницы ужаснулись: что же будет. Но Великая княгиня подошла к каждой из девочек и всем поцеловала ручки. Плакали при этом все - такое умиление и благоговение было на лицах и в сердцах.

"Великая матушка" надеялась, что созданная ею Марфо-Мариинская обитель милосердия расцветет большим плодоносным древом. Со временем она собиралась устроить отделения обители и в других городах России.

Великой княгине была присуща исконно русская любовь к паломничеству.

Не раз ездила она в Саров и с радостью спешила в храм, чтобы помолиться у раки преподобного Серафима. Ездила она в Псков, в Оптину пустынь, в Зосимову пустынь, была в Соловецком монастыре. Посещала и самые маленькие монастыри в захолустных и отдаленных местах России. Присутствовала на всех духовных торжествах, связанных с открытием или перенесением мощей угодников Божьих. Больным паломникам, ожидавшим исцеления от ново прославляемых святых, Великая княгиня тайно помогала, ухаживала за ними. В 1914 году она посетила монастырь в Алапаевске, которому суждено было стать местом ее заточения и мученической смерти.