Другим методом, который попытались применить для восстановления индукции ферментов у старых животных, был метод стимулирования регенерации ткани. Было показано, что активность митохондриальной малатдегидрогеназы понижается в печени молодых крыс после удаления надпочечника, но не меняется при этой же операции у старых животных [53]. Введение кортизона вызывает индукцию фермента у молодых крыс и не вызывает у старых. Однако если у старых крыс провести частичную гепатэктомию, дать печени возможность регенерировать в течение трех дней и затем ввести кортизон, то количество фермента увеличится. Таким образом, в отношении индукции митохондриальной малатдегидрогеназы регенерирующая печень старых крыс функционирует так же, как печень молодых. По-видимому, это нарушение индукции, связанное со старением, может быть ликвидировано. Наиболее значительным результатом этой работы является вывод о том, что молекулярные изменения, которые происходят в организме в процессе старения животного, могут быть обращены вспять. Однако клетки печени делятся на протяжении всей жизни, так как эти клетки являются премитотическими. Поэтому печень и способна к регенерации. Многие другие органы, такие, как мозг, сердце, скелетные мышцы, не могут регенерировать, так как их клетки теряют способность делиться на очень ранней стадии развития и становятся постмитотическими. Обратимы ли изменения, происходящие в старческом возрасте в этих органах?

В связи с упомянутыми исследованиями возникает еще один вопрос — обусловлено ли нарушение индукции малатдегидрогеназы в печени старых крыс уменьшением содержания специфических рецепторов кортизона или оно обусловлено репрессией гена малатдегидрогеназы? Поскольку активность малатдегидрогеназы в печени нормальных старых крыс высокая, появление репрессора в старческом возрасте, по-видимому, маловероятно. Чтобы ответить на поставленные вопросы, очевидно, важно измерить количество кортизон-специфического рецептора в печени старых крыс.

Описанные выше исследования показывают, что такие факторы, как гормоны и их рецепторы, важны для поддержания уровня и адаптивного ответа ферментов в различных возрастах. Изменения содержания этих факторов в старости могут вызывать изменения в транскрипции и трансляции и, таким образом, влиять на содержание ферментов. Это может в свою очередь приводить к функциональным сдвигам в органах и в организме в целом.

Измерения К_м, K_i, молекулярной массы, электрофоретической подвижности, антигенности и тепловой инактивации ферментов дают ценную информацию об их молекулярных свойствах. При исследовании ферментов, выделенных из органов молодых и старых животных, подобные измерения полезны при решении вопроса о том, одинакова ли структура ферментов, синтезированных в старых и молодых организмах. Если структурные различия не наблюдаются, то, по-видимому, в течение всей жизни фермент кодируется одним и тем же геном, не претерпевающим структурных изменений. Если же различия есть, то это означает, что на различных стадиях жизни функционируют разные гены или же происходят изменения в нуклеотидах, вызывающие изменения кодонов. Вместе с тем такие ошибки в строении молекул белка, как замена аминокислот, могут вноситься в ходе синтеза белка. Для соответствующих исследований требуются в высокой степени очищенные ферменты. Трудность этих исследований заключается в том, что если изучаемый фермент имеет изоферменты и доминирующей формой в одном возрасте является один изофермент, а в другом — другой, то кинетические параметры фермента могут быть различны. Поэтому прежде всего нужно установить, имеет ли изучаемый фермент изоферменты. Если суметь преодолеть трудности, в подобных исследованиях можно получить полезную информацию.

Как функции возраста были измерены кинетические параметры только небольшого числа ферментов на неполностью очищенных препаратах. Это ацетилхолинэстераза [81] и пируваткиназа [22] мозга; миозиновая АТРаза [51, 105] и альдолаза скелетных мышц [38]; пероксид-дисмутаза [93], цитоплазматическая аланинаминотрансфераза [87] и альдолаза [39] печени млекопитающих.

В табл. 3.5 приведены различные кинетические параметры ферментов, выделенных из органов молодых и старых крыс. В целом видно, что существенной разницы в К_м, K_i, молекулярной массе и электрофоретической подвижности нет. Однако удельная активность альдолазы [39] и пероксид-дисмутазы [93] старых крыс составляет только 30–70 % активности этих ферментов у крыс среднего возраста. Ферменты старых крыс, кроме того, более термолабильны. Эти различия были объяснены посттрансляционными модификациями [37].

Таблица 3.5. Сравнение кинетических свойств очищенных ферментов, полученных в молодом и старом возрасте

Поскольку были изучены молекулярные свойства только нескольких ферментов, определенных заключений сделать пока нельзя. Однако данные по тем ферментам, кинетические параметры которых известны, показывают, что в организмах молодых и старых животных синтезируются одни и те же молекулы. Следовательно, гены, ответственные за их синтез в разных возрастах, по-видимому, одни и те же. Небольшие различия, наблюдаемые в случаях аланинаминотрансферазы молодых и старых крыс, могут быть связаны со сменой форм изофермента, как это показано Патнайком и Канунго [87]. Различия в удельной активности и термолабильности пероксид-дисмутазы и альдолазы были отнесены к посттрансляционным модификациям [37] (гл. 9).

Была выдвинута и альтернативная точка зрения, заключающаяся в том, что старение происходит в результате прогрессивного нарастания с течением времени числа ошибок в молекулах белка. Эта точка зрения основана на том, что с возрастом постепенно увеличивается неактивная фракция молекул фермента [47, 48, 84] (гл. 9). С ней трудно согласовать понижение в старости удельной активности пероксид-дисмутазы, с одной стороны, и повышение удельной активности миозиновой АТРазы — с другой. В последнем случае К_м и V_max в старости повышаются, что может происходить благодаря конформационным изменениям, индуцированным эффектором. Ряд авторов считает [44, 93], что некоторые изменения кинетических параметров пероксид-дисмутазы и фосфоглицераткиназы нельзя объяснить ошибками в синтезе; скорее всего, они возникают из-за посттрансляционных модификаций — таких, как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д. Было бы интересно выяснить, каким образом в старости происходят такие посттрансляционные модификации (детальное обсуждение этого вопроса приведено в гл. 9).

Как функции возраста животных были изучены различные аспекты функционирования ферментов — их активность, формы изоферментов, индукция, кинетические параметры. Активность некоторых ферментов, выраженная в Ед.·мг^-1 белка и в Ед.·мг^-1 ДНК, в старости понижается, в то время как других — повышается. Для некоторых ферментов никаких изменений не обнаруживается. Не выявлено никаких специфических закономерностей в изменениях ферментов отдельных классов, одного и того же органа или клеточной органеллы. Поскольку каждый метаболический путь включает в себя ферменты, относящиеся к различным классам, особую ценность имеют исследования всех ферментов данного пути в одинаковых условиях.

Изучение изменения набора изоферментов дало полезную информацию о типах изменений, которые происходят на уровне генома и ответственны не только за смену изоферментов, но также и за активность ферментов. Смена изоферментов может нарушить точный и тонкий контроль метаболических путей из-за различий изоферментов в сродстве к субстратам и эффекторам. Это может вызывать значительные изменения в активности метаболических процессов и приводить к функциональным изменениям всего организма. Сдвиг к Н₄-ЛДГ в мозгу, сердце и скелетных мышцах крысы в старости может сделать эти ткани более аэробными. Сдвиг к цААТ-В в печени крысы в старости таким же образом может вызвать изменение в метаболизме аминокислот. Повышение относительного содержания некоторых изоферментов свидетельствует о повышении активности соответствующих генов. Такие изменения в функции гена в старости могут быть вызваны появлением или исчезновением в этом возрасте ряда факторов или эффекторов.