Оборонительное вооружение Ер-2 состояло из трех пулеметов. В носовой части фюзеляжа находилась установка типа ДБ-3Ф, на которой в шаровом шарнире крепился 7,62-мм пулемет ШКАС. Питание последнего осуществлялось разборной лентой из ящика на 1000 патронов. Стреляные гильзы и звенья собирались в мешке, присоединенном к пулемету.

В нижнем люке находилась выдвижная установка МВ-2 со вторым пулеметом ШКАС. В походном положении она была спрятана в фюзеляже, в боевом же опускалась вниз (предварительно следовало открыть люк). Стрелок вел огонь с колена, прицеливаясь через перископический прицел ОП-2Л. Выступающая в поток часть установки прикрывалась обтекателем, боковые створки которого изготовлялись из плексигласа. Штырь-ограничитель не давал направить ствол на хвостовое колесо. Питание пулемета осуществлялось лентой из коробки на 1000 патронов.

Сверху на фюзеляже размещалась экранированная турель ТАТ-БТ с 12,7-мм пулеметом БТ. Она имела убирающийся аэродинамический компенсатор. Питание пулемета — из сменных магазинов, каждый с лентой на 40 патронов. В боекомплект входили пять магазинов, четыре из которых укладывались в ниши по бортам фюзеляжа.

Первые Ер-2 стали поступать в сформированный в Воронеже и вошедший в состав 81-й авиадивизии 420-й дальнебомбардировочный авиаполк (дбап) под командованием Н. И. Новодранова. Полк комплектовался в основном летно-техническим составом из 100-го дбап и ГВФ. Переучивание личного состава полка началось 24 июня 1941 г., а спустя месяц потеряли первый бомбардировщик. 24 июля при выполнении сдаточного полета на заводе № 18 в районе аэродрома Россошь Ер-2 (заводской № 705) был дважды атакован и обстрелян истребителем И-16. Дело в том, что наших зенитчиков своевременно не ознакомили с силуэтами новых советских самолетов. Особенно бросалось в глаза двухкилевое оперение, присущее также немецкому двухмоторному истребителю Мессершмитт Bf 110. После второй атаки самолет загорелся. Летчик-испытатель Воронежского авиационного завода майор К. К. Рыков и ведущий инженер НИИ ВВС военинженер 2-го ранга Н. М. Кокорин выпрыгнули с парашютами. Бортрадист Сафонов и борттехник Серегин погибли.

Как вспоминал дважды Герой Советского Союза летчик А. И. Молодчий, «мы «учили летать» Ер-2 и в то же время учились сами. Летчикам нашего полка Ер-2 понравился с первых полетов: машина имела хорошие летно-тактические данные, а в максимальной скорости, потолке имела превосходство над многими отечественными и зарубежными самолетами такого же класса. Об этом мы говорили и конструктору самолета В. Г. Ермолаеву, который часто бывал у нас на аэродроме. Но, к сожалению, приходилось вести речь и о другом, о недостатках. Владимир Григорьевич внимательно прислушивался к нашим замечаниям и принимал все меры, чтобы быстрее устранить производственные и другие дефекты…»

Самым загадочным оставались пожары на двигателях. Устранить их помог механик, зайцем проникший на борт и наблюдавший за всем происходящим в полете. Причина заключалась в неудачном расположении дренажных трубок карбюраторов. По словам Молодчего, стоило лишь удлинить эти трубки, выведя их за пределы капотов, как пары бензина перестали скапливаться в подкапотном пространстве, и возгорания прекратились.

10 августа, когда 28 Ер-2 перелетели из Воронежа на аэродром г. Пушкина под Ленинградом, начался отсчет боевых будней. Вечером этого же дня, вслед за ТБ-7 стали отправляться на Берлин и Ер-2. По приказу П. Ф. Жигарева первые перегруженные машины поднимали с грунтовой взлетно-посадочной полосы опытные пилоты: заместитель командира 420-го дбап А. Г. Степанов, заместитель командира эскадрильи лейтенант В. М. Малинин и командир звена лейтенант Б. А. Кубышко. Четвертым рулил младший по званию и опыту летчик А. И. Молодчий. Его самолет оторвался от земли на самом краю аэродрома, и преждевременно увеличенный взлетный угол привел к потере скорости. Бомбардировщик, коснувшись земли, угодил колесами в дренажную канаву. После этого старт остальных Ер-2 прекратили.

До Берлина долетели, видимо, три машины, а домой вернулся только экипаж летчика В. М. Малинина. Самолет Степанова взорвался над целью, а экипаж пропал без вести, Ер-2 Кубышко был сбит своими же истребителями.

В начале июля 1941 г. начал формироваться еще один полк — 421-й дбап, также из 28 Ер-2. В конце августа его ввели в состав 81-й авиадивизии. В начале войны полк действовал с аэродрома, расположенного под Владимиром.

С наступлением осени остро встал вопрос о подготовке самолетов для боевых действий зимой. В связи с этим командир дивизии А. Е. Голованов, сменивший на этом посту М. В. Водопьянова, в письме наркому Шахурину потребовал поручить заводу № 240 подготовить и установить на Ер-2, находившихся в обоих авиаполках, 100 комплектов антиобледенителей на винты и 50 комплектов на крылья и стабилизаторы. Предлагалось также разработать форточки для фонарей кабин пилота и штурмана, лыжи, в том числе и взлетные. Там же отмечалось, что «после трех боевых вылетов… на Ер-2 обнаружена настолько сильная коррозия труб водяной системы, что на одном самолете во время боевого полета отвалилась труба, идущая от радиатора к мотору».

На 30 сентября 420-й полк насчитывал 21 исправный Ер-2. Самолеты отличались неплохой живучестью. Однажды, попав под обстрел, загорелся один из моторов на машине Молодчего. Вернулись домой фактически на одном моторе, а когда приземлились, обнаружили две дыры в кабине стрелков и множество мелких пробоин, в том числе и в бензобаках, не хватало одной шайбы вертикального оперения, а колеса оказались разбитыми. Можно сказать, прилетели на честном слове.

В начальный период войны оба полка работали не столько по дальним, сколько по ближним целям. Это диктовала обстановка, сложившаяся на фронтах. Из-за больших потерь Ер-2 экипажи 420-го дбап, в том числе и Молодчего, первым в полку удостоившегося звания Героя Советского Союза, в декабре 1941 г. пересели на Ил-4. Но Ер-2 421-го дбап подполковника А. Г. Гусева продолжали воевать. Этой же осенью, после реорганизации 81-й дивизии, полк Ер-2, провоевавший до конца 1943 г., переименовали в 747-й дбап и перебазировали в Иваново, а весной 1942 г. — в подмосковное Кратово на аэродром ЛИИ.

14 марта 1942 г. командир 747-го дбап подполковник Гусев и военком старший батальонный комиссар Кошелев в письме Ермолаеву сообщали: «За шесть месяцев боевой работы полка на самолетах «Ер-2» совершено около 500 боевых вылетов днем и ночью с налетом 2000 часов и успешным решением разнообразных боевых задач, включительно до полетов на радиус (11–12 час.).