С самого начала работы на кафедре физиологии Сеченов возобновил интенсивные научные исследования.

«Лабораторию мне дали в нижнем этаже надворного флигеля, рядом с анатомическим театром, — вспоминал Сеченов. — Она состояла из двух больших комнат, служивших некогда химической лабораторией».

В этих-то невзрачных комнатах с ледяным погребом под ногами были выполнены замечательные исследования по физиологии нервной системы — исследования, сделавшие имя Сеченова знаменем прогрессивного русского естествознания.

Уже первые научные труды Сеченова, выполненные в то время, и его лекции по электрофизиологии, удостоенные высшей награды Академии наук, ясно показали, что в русскую науку вошёл большой, самобытный талант. И отнюдь не случайно группа учёных решила выдвинуть Ивана Михайловича в действительные члены Академии наук.

Осенью 1861 года Сеченов познакомился с Марией Александровной Боковой и её подругой Н. П. Сусловой. Обе молодые женщины хотели получить высшее образование, стать врачами. Но поступить в университет они не могли — в то время в России путь к высшему образованию для женщин был закрыт. Тогда Бокова и Суслова стали посещать в качестве вольнослушательниц лекции в Медико-хирургической академии и, невзирая на трудности, изучать медицину.

Сеченов горячо сочувствовал стремлению русских женщин к высшему образованию и поэтому с большой охотой помогал им в учении. Более того, в конце академического года он дал обеим своим ученицам темы для научных исследований. Обе ученицы Сеченова под его руководством выполнили докторские диссертации и защитили их в Цюрихе.

Впоследствии Мария Александровна Бокова стала женой Сеченова, его неизменным другом.

Осенью 1862 года учёный получил годовой отпуск и отправился в Париж. В столицу Франции его привело желание поближе познакомиться с исследованиями знаменитого Клода Бернара и самому поработать в его лаборатории. Это ему удалось. Сверх того, в знаменитом Коллеж де Франс он прослушал курс лекций по термометрии.

Самым значительным результатом исследований, проведённых Сеченовым в Париже, было открытие так называемого центрального торможения — особых механизмов в головном мозге лягушки, подавляющих или угнетающих рефлексы. Об этом Сеченов сообщил в работе, опубликованной в 1863 году сначала на французском, а затем на немецком и русском языках.

В том же году российский журнал «Медицинский вестник» опубликовал статью Сеченова «Рефлексы головного мозга». Учёный впервые показал, что вся сложная психическая жизнь человека, его поведение зависят от внешних раздражителей, а не от некоей загадочной «души». Всякое раздражение вызывает тот или иной ответ нервной системы — рефлекс. Рефлексы бывают простые и сложные. В ходе опытов Сеченов установил, что мозг может задерживать возбуждение. Это было совершенно новое явление, которое получило название «сеченовского торможения».

Открытое Сеченовым явление торможения позволило установить, что вся нервная деятельность складывается из взаимодействия двух процессов — возбуждения и торможения. Сеченов экспериментально доказал, что если у собаки выключить обоняние, слух и зрение, то она будет всё время спать, поскольку в её мозг не будет поступать никаких сигналов из внешнего мира.

Эта статья сразу же, как свидетельствуют современники, стала известной в самых широких кругах русского общества.

«Мысли, изложенные в „Рефлексах“, были так смелы и новы, анализ натуралиста проник в тёмную область психических явлений и осветил её с таким искусством и талантом, что потрясающее впечатление, произведённое „Рефлексами“ на всё мыслящее общество, становится вполне понятно», — писал видный русский физиолог Н. М. Шатерников.

Неудивительно, что материалистические взгляды Сеченова вызвали преследование со стороны властей. Он подвергся судебному преследованию.

Сеченов чрезвычайно спокойно встретил известие о попытке возбуждения против него судебного дела. На вопросы друзей об адвокате, который будет защищать его на суде, Сеченов ответил: «Зачем мне адвокат? Я возьму с собой в суд лягушку и проделаю перед судьями все мои опыты: пускай тогда прокурор опровергает меня».

Очевидно, боязнь окончательно оскандалиться в глазах русского общества, да и всей Европы, вынудила царское правительство отказаться от судебного процесса над автором «Рефлексов» и, скрепя сердце, разрешить издание книги. Однако великий физиолог, краса и гордость России, на всю жизнь остался для царского правительства «политически неблагонадёжным».

В 1866 году выходит из печати классический труд Сеченова «Физиология нервной системы». В предисловии к этой книге он коротко, в нескольких фразах, изложил своеобразное кредо физиолога-экспериментатора: «Написать физиологию нервной системы побудило меня главнейшим образом то обстоятельство, что во всех, даже лучших учебниках физиологии в основу частного описания нервных явлений кладётся чисто анатомическое начало… я же с первого года преподавания нервной системы стал следовать другому пути, именно описывал на лекциях нервные акты так, как они происходят в действительности».

Особую важность в «Физиологии нервной системы», как считает известный советский психолог М. Г. Ярошевский, имеет высказанная здесь идея о саморегуляции и обратных связях, одна из генеральных сеченовских идей, развитая в дальнейшем кибернетикой. Эта идея привела Сеченова к понятию о сигнале и об уровне организации сигналов как регуляторов поведения.

Нервную систему изучал Сеченов и во время годичного отпуска в 1867 году; большую часть этого отпуска он провёл в Граце, в лаборатории своего старого друга профессора Роллета. Даже отпуск Иван Михайлович всегда использовал для работы.

После десяти лет труда он ушёл из академии и некоторое время работал в лаборатории, которой руководил Д. И. Менделеев. Затем в течение ряда лет был профессором Новороссийского университета.

Не переставая заниматься физиологией нервной системы, Сеченов заинтересовался новой, чрезвычайно важной и малоизученной проблемой — состоянием углекислого газа в крови. «Этот, с виду простенький вопрос, — писал Сеченов, — потребовал для своего решения не только опытов со всеми главными составными частями крови порознь и в различных сочетаниях друг с другом, но в ещё большей мере опытов с длинным рядом соляных растворов». Стремясь раскрыть секреты важнейшего физиологического процесса поглощения кровью из тканей и отдачи углекислоты, Сеченов глубоко изучал его физико-химическую сущность, а затем, расширив рамки исследования, делает в дальнейшем крупные открытия в области теории растворов.

В сентябре 1869 года он стал членом-корреспондентом Императорской Санкт-Петербургской академии наук.

Весной 1876 года Сеченов вновь приехал в город на Неве и вступил в должность профессора кафедры физиология физико-математического факультета Петербургского университета.

Невзирая, однако, на эти трудности, Сеченов развернул здесь разнообразные физиологические исследования и получил ценные результаты. Он в основном завершил свои работы, связанные с физико-химическими закономерностями распределения газов в крови и искусственных солевых растворах, а в 1889 году ему удалось сформулировать «уравнение Сеченова» — эмпирическую формулу, которая связывает растворимость газа в растворе электролита с его концентрацией. Это уравнение и сейчас находится на вооружении науки.

К этому времени относится начало изучения газообмена человека. У Сеченова, как и у широкой научной общественности, большой интерес вызвала сенсация тех лет — полёт трёх французских воздухоплавателей на аэростате «Зенит», поднявшихся на высоту 8 километров. Однако полёт этот завершился трагически: двое воздухоплавателей погибли от удушья. Сеченов проанализировал причины их гибели и в декабре 1879 года в докладе на VI съезде естествоиспытателей и врачей высказал мысль об особенностях физиологических процессов, протекающих в человеческом организме при пониженном давлении воздуха.

Исключительно одарённый и яркий человек, прогрессивный по своим научным взглядам и общественным убеждениям, блестящий лектор, Сеченов пользовался огромным авторитетом среди студентов, но начальство его не терпело.