Предотвращение скрытого заражения с помощью инокуляции нижней стороны агара.

При последовательных переносах мицелия в нефильтрованной атмосфере, в нем могут аккумулироваться контаминанты, даже если в агаре всегда присутствует перекись, а мицелий никогда не осваивает всей поверхности чашки. Вы можете никогда не увидеть заражения, растущего на грибном мицелии в чашках, но при этом невидимые микроорганизмы будут понемногу обустраиваться на месте. Такое «тайное заражение» может представлять проблему вне зависимости от того, используете вы перекись в посевном и основном субстрате, или нет. Естественно, что при использовании не защищенного перекисью посевного или плодоносящего субстрата скрытые заражения могут расцвести на незащищенной среде с большей вероятностью.

Для того, чтобы предотвратить возможность такого скрытого заражения, я использую несложный прием: осуществляя переносы мицелия, я регулярно инокулирую нижнюю сторону агара (Как часто это делать, зависит от способа и времени хранения чашек. Безопаснее всего производить эту операцию каждый раз при переносе мицелия и как минимум с теми чашками, которые используются для переноса на последующие чашки. Вместе с тем, можно пропустить два или три переноса, прежде чем вы заметите какое-либо влияние на их успешное завершение). Я выполняю инокуляцию нижней стороны агара следующим образом:

1. Переворачиваю чашку вверх дном

2. Приподнимаю одну сторону малой чашки, как будто она скреплена шарниром с большой чашкой, и, с помощью простерилизованного на пламени скальпеля аккуратно отделяю через образовавшуюся щель агаровый диск, чтобы он переместился на большую чашку (если агар рвется или ломается на этом этапе, увеличьте его количество при подготовке среды.

3. Опускаю малую чашку на место, а затем, по мере готовности, переношу кусочек мицелия на открытую нижнюю сторону агара при помощи стерилизованного на пламени и охлажденного скальпеля.

4. В заключение, после инокуляции нижней стороны агара, закрываю чашку, переворачиваю ее и аккуратно, приподняв большую чашку, через образовавшуюся щель при помощи стерилизованного на пламени скальпеля возвращаю агаровый диск на место, т. е. на дно малой чашки. Агаровый диск теперь покрывает кусочек мицелия.

Эта манипуляция заставляет мицелий прорастать с нижней стороны агара сквозь среду на поверхность агарового диска, оставляя в процессе роста все источники заражения позади себя. Некоторые штаммы могут плохо реагировать на подобную методику, но у меня с этим пока что не было никаких проблем, потому что штаммы, которые я использовал, росли на среде весьма активно.

Вместе с тем, такая процедура заметно повышает риск заражения, по сравнению с простыми переносами, что связано с вовлечением в процесс дополнительных манипуляций. В то время, как я редко вижу заражения на агаровых чашках, инокулированных обычным способом (если среда достаточно свежая), при инокуляции нижней поверхности агара заражению подвергается примерно каждая пятая чашка.

Протирание поверхности стола и ваших пальцев спиртом перед началом работы поможет снизить число неудач.

В рассмотренной процедуре есть один не очень простой, но очень важный момент. При инокуляции нижней части агарового диска следует избегать соскребания частиц агара кромкой малой чашки, когда вы закрываете ее после завершения переноса. На частицах агара, которые попадают на кромку или внешнюю сторону малой чашки, часто начинают свой рост вредные микроорганизмы, что связано с близостью окружающего воздуха. По этой же причине я советую использовать чашки, подсушенные должным образом, когда на их поверхности отсутствуют видимые капли воды. Если агаровый диск при перемещении из малой чашки в большую является слишком влажным, то после обратного перемещения на большой чашке может остаться достаточно агара, чтобы привести к последующему заражению на кромках.

И заключительный совет: при извлечении агаровых клиньев из чашки, инокулированной на нижней поверхности агарового диска, не режьте агар на всю глубину. В противном случае, сама идея процедуры, с помощью которой мы пытаемся оставить скрытые источники заражения на нижней части агара, теряет смысл. Для того, чтобы не переносить заражение вместе с чистой культурой, следует вырезать клинья только из поверхностной части агарового диска.

После того, как чашки инокулированы (я держу по 4 чашки каждого штамма), я перемещаю их внутрь новых пластиковых пищевых пакетов, верх которых завязываю узлом. Закрытый пакет обеспечивает неподвижность воздушной среды и предохраняет чашки от мародерствующих грибных комариков и клещей. В один пакет я помещаю три или четыре чашки петри. После этого их можно поместить на инкубацию в подходящее место: на книжную полку, в шкаф, на стол и т. п. Тем не менее, я не рекомендую хранить чашки в холодильнике из-за проблем с конденсацией, равно как и на полке над обогревателем, потому что циклическое нагревание и охлаждение может вызвать попадание микроорганизмов внутрь чашек.

Возможность хранения свежих (не инокулированных) чашек в обычных условиях является одним из преимуществ перекисного метода. Я держу набор свежих чашек в прохладном месте (повторюсь — не в холодильнике). Как и в случае с инокулированными чашками, я храню их в пищевых пластиковых пакетах. Каждый раз, когда я использую какую-либо культуру для инокуляции посевного субстрата, я также беру одну из свежих чашек и инокулирую ее взамен использованной. На этом же этапе я удаляю культуры, на которых имеются признаки заражения плесенью по кромке. Таким образом, количество чашек с растущим мицелием остается постоянным и я редко сталкиваюсь с проблемой нехватки культур.

Производство посевного мицелия

Производство посевного мицелия является второй стадией в процессе выращивания грибов. Посевной мицелий — это «стартер», используемый для инокуляции основного субстрата или для получения дополнительного посевного мицелия. По сложившейся традиции, изготовление посевного мицелия всегда оставалось прерогативой коммерческих производителей, имеющих стерильные условия для обеспечения защиты мицелия от заражений. Тем не менее, при использовании перекисного метода производство посевного мицелия становится просто еще одним шагом в процессе выращивания грибов, причем не самым сложным.

Возможность производить собственный посевной мицелий в нестерильных условиях приносит заметную экономическую выгоду для мелкомасштабного или домашнего грибоводства. Покупка мицелия по цене от $20 до $25 за пару килограммов приводит к заметным расходам. Если вы производите ту же самую пару килограммов самостоятельно с использованием перекиси, то зерно обойдется вам в один или два доллара, а перекись — в 10 центов (опилки стоят еще дешевле, если вообще не бесплатно). К тому же, вам не придется тратить деньги на такие сомнительные вещи, как оборудование ламинарных боксов или стерильных помещений для инкубации посевного мицелия.

Занимаясь выращиванием грибов, я практически полностью перешел на использование опилочного посевного мицелия. По моим нынешним методикам опилочный субстрат может быть приготовлен быстрее и проще, чем зерновой, без необходимости замачивания зерна и даже без автоклавирования или стерилизации под давлением (см. ниже). Кроме того, зрелый опилочный мицелий колонизирует опилочный же субстрат быстрее и, как показывает мой опыт, с менее частыми случаями заражения плесенью. Заражения самого посевного мицелия также редки, может быть одна банка на сотню, что связано со случайными заражениями, которые неизбежны при допущении ошибок при работе. Конечно, опилочный мицелий не добавляет столько же питания в основной субстрат как зерно, но эта проблема легко решается путем внесения недостающих питательных веществ прямо в субстрат из других источников, которые не требуют стерилизации под давлением.