Условия разделения: прибор КЭ — Beckman P/FCE 2000; капилляр 75 мкм, 50/57 см; поле 439 В/см; ввод пробы давлением 8 с, буфер при прямом УФ-детектировании — 50 мМ борат, pH 9.5, при непрямом УФ-детектировании — 5 мМ эфедрин/серная кислота, pH 7.5; прямое УФ-детектирование — 200 нм, непрямое — 254 нм; пробы — амины в воде.

9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков

В КЗЭ белков между молекулами пробы и стенками капилляра могут возникнуть сильные, в основном электростатические, взаимодействия. Они происходят между отрицательно заряженными сила-нольными группами поверхности и положительно заряженными функциональными группами пробы. Некоторую дополнительную роль могут играть также неспецифические взаимодействия с образованием водородных мостиков или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Адсорбция молекул белков на стенках капилляра может отрицательно сказываться на разделении при КЭ и поэтому нежелательна. Она приводит к ухудшению воспроизводимости времен миграции, уширению и асимметрии пиков, и даже к необратимой адсорбции компонентов пробы. Поэтому при работе с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц основательно промыть капилляр (например, NaOH). При этой операции молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются, и воспроизводимость системы улучшается. Существует несколько возможностей подавления нежелательных взаимодействий между белками и стенками капилляра.

9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах

9.1.1. Значения pH

При значениях pH выше изоэлектрической точки (р!) белки существуют в анионной форме, то есть имеют те же заряды, что и стенки капилляра и во время разделения отталкиваются от них. Поскольку очень многие белки имеют значения pi, лежащие в области от нейтральных до слегка кислых, буфер для КЭ должен иметь явно щелочные значения pH (pH 9-11). Однако, в случае сильно основных белков (pH > 10) эта возможность достигает своих естественных границ. Кроме этого, в данном случае дают себя знать высокая электропроводность применяемого буфера и отрицательно сказывающееся явление денатурирования, которое может возникнуть в этих характерных условиях. На рис. 57 показано разделение белков в немодифицированном капилляре при pH 11.5.

Рис. 57. Разделение белков при pH 11.5 в немодифицированном капилляре.

_{Буфер: 100 мМ борат, pH 11.5; пробы: 1 — DMF, 2 — РНК крупного рогатого скота, 3 — миоглобин кита, 4 — миоглобин лошади, 5 — кональбумин, 6 — β-лактоглобулин, 7 — бычий сывороточный альбумин (БСА), 8 — ферритин, 9 — α-амилоглюкозидаза.}

В кислой области pH (рН<2) адсорбция белков также может уменьшаться вследствие протонирования силанольных групп и устранения тем самым отрицательного заряда поверхности. В данном случае проблемы представляют очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Использование крайних значений pH для анализа биополимеров ограничивает селективность системы, поскольку разница в зарядах анализируемых веществ заметно уменьшается. Кроме того, выгодно иметь в качестве свободно изменяемого параметра значение pH. Скорость движения заряженных проб в КЗЭ определяется степенью их ионизации, которую можно легко регулировать величинами pH. Наилучших результатов можно достичь, выбирая высокие концентрации буфера и область pH чуть ниже 3. На рис. 58 представлены некоторые тестовые буферы для разделения основных белков.

Рис. 58. Разделение стандартных белков в различных буферных системах.

_{Условия: прибор самодельный с быстросканирующим детектором, капилляр 50 мкм, 37/44 см, поле: 341 В/см; ввод пробы гидродинамический, 15 см, 2с; детектирование 214 нм; буфер фосфатный; проба: цитохром С, лизоцим, ри-бонуклеаза А.}

Повышение pH от 2.4 до 4.7 при концентрации буфера 25 мМ приводит к явному уменьшению интенсивности пика, в то время как при повышении концентрации свыше 50 мМ (pH 4.3) до 100 мМ (pH 4.2) наблюдается заметное увеличение интенсивности пика.

И для этих буферов с высокой концентрацией можно улучшить проявления пика уменьшением значения pH до 2.9. Однако в данном случае, вследствие крайне высокой подвижности протонов (кислые значения pH), резко увеличивается ЭОП.

Поэтому дальнейшая оптимизация в сторону более кислых значений pH удается только с одновременным разбавлением разделяющего буфера, которое вызывает уменьшение интенсивности пика, Кроме того, работа в очень кислой области (pH 2.3) приводит к уменьшению селективности. Этот способ оптимизации разделения стандартных белков показан на рис. 58.

9.1.2. Добавление солей к буферу

В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных pH) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок — стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области pi (pi 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение!) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и ξ-потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа.

В качестве буферных веществ могут служить также цвиттерионные молекулы (внутренние соли), которые обладают большой буферной емкостью, но не вносят значительного вклада в общую электропроводность системы. Цвиттерионы могут образовывать ассоциаты с белками и поверхностью капилляра и, тем самым, уменьшать адсорбцию белков. За счет применения аминосульфоната, аминосульфата и, в последнее время, фосфонийсульфоната в очень высоких концентрациях в качестве добавок к фосфатному буферу в нейтральных условиях можно разделять как основные, так и кислые белки.

9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу

Недостаток заключается в возможной денатурации белка.

9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров)

Простейший метод модифицирования поверхности кварцевого капилляра состоит в добавлении к буферному раствору такого компонента, который предпочтительнее адсорбируется на поверхностных силанольных группах. Формирование такого адсорбционного слоя дополнительно влияет на ЭОП и уменьшает адсорбцию вследствие гидрофобного или электростатического отталкивания. Разделяющие системы, применяемые в основном для разделения белков в немодифицированных капиллярах, приведены в таблице 22.