7.4. Области применения
Электрофорез в гомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поля является стандартным методом, который особенно эффективен при разделении маленьких молекул с постоянным зарядом. Поэтому можно без больших трудностей разделить алифатические и ароматические карбоновые кислоты, сульфокислоты, аминокислоты, фенолы, нуклеотиды и амины. Показательные примеры разделений, имеющих важное прикладное значение, приведены в двух обзорных статьях Кура (см. список литературы).
Рис. 39. Факторы, влияющие на КЗЭ.
Примером может служить разделение природной смеси танинов, представленное на рис. 40. Показаны также УФ-спектры, записанные в режиме реального времени с помощью ДМД.
Рис. 40. Разделение смеси танинов (галловых кислот).
Как типичное применение КЗЭ, в следующей главе будет описано разделение ионов, не имеющих собственного УФ-поглощения. С помощью КЗЭ может также осуществляться разделение белков, если подавляется обменное взаимодействие между пробой и стенками капилляра. Этому разделению также посвящена отдельная глава.
Разделение заряженных молекул с относительно большими гидрофобными остатками можно улучшить добавлением ДЦСН; возможности оптимизации разделения методом КЭ с добавлением детергента подробно обсуждаются в разделе, посвященном мицеллярной электрохроматографии.
8. Непрямое УФ-детектирование в КЭ
Вещества, которые во всей УФ-области обладают небольшим коэффициентом экстинкции, часто необходимо вводить в высокой концентрации, для того, чтобы получить сигнал этого соединения в детекторе. Однако для такой пробы разделительная система часто бывает перегружена и интенсивность пиков так мала, что невозможно практическое применение такого разделения. Существенно чувствительнее такие вещества могут анализироваться при использовании других принципов детектирования (детектирование по электропроводности, потенциометрическое детектирование). Но поскольку до настоящего времени нет других детекторов для рутинных исследований в коммерческих приборах КЭ, непрямое УФ-детектирование в КЭ имеет особенное значение.
Этот вариант УФ-детектирования известен в хроматографии с начала 80-х годов и применялся для детектирования ионов в ионно-обменной хроматографии (ИОХ). С помощью традиционных УФ-детекторов могут также обнаруживаться непоглощающие в УФ-области вещества. Недостатки этого метода заключаются в следующем: 1 — появление так называемых "системных пиков", которые необходимо разделить от зон веществ при помощи дополнительного оптимизирования разделения; 2 — необходимость работы с высокими концентрациями буфера для вымывания проб из стационарной фазы, что в случае толстых слоев покрытия капилляра в ВЭЖХ приводит к большой величине адсорбции на стенках и, тем самым, к повышению шумов и других помех. Большого развития этот метод не получил, поскольку появление детекторов по теплопроводности в ВЭЖХ при рутинных измерениях составило ему сильную конкуренцию. Кроме того, сочетанием детектирования по теплопроводности с техникой подавления ЭОП в рутинных измерениях удается увеличивать чувствительность детектирования в 10-100 раз.
В КЭ техника непрямого УФ-детектирования описана уже давно, еще до того, как стали известны ее большие возможности. Только позднее, в работах Джандика (Jandik) и Джонса (Jones) были выяснены преимущества применения непрямого УФ-детектирования в КЭ. Наряду с короткими временами анализов для многих анионов этот метод показал чрезвычайно низкую границу обнаружения в области концентраций от 0.1 мг/л и ниже.
8.1. Непрямое УФ-детектирование анионов
Из теории следует, что для детектирования анионов, непоглощающих в УФ-области, необходимо найти такую буферную систему, которая сама хорошо поглощает в этой области. При этом подвижность ионов буфера должна быть близка к подвижности анализируемых веществ. В качестве детектора анионов с большой и средней подвижностью подходят хромат-ионы, вводимые в раствор серной кислоты с концентрациями от 2 до 10 мМ. Для анализа быстрых и медленных анионов в одном потоке необходимо остановить или, что лучше, обратить направление потока и поменять полярность источника напряжения. В кварцевых капиллярах и приборах КЭ с нормальной полярностью (катод на выходе), как показано на рис. 41, в направлении детектора (к выходу) движутся только медленные анионы, в то время как быстрые анионы сразу после ввода пробы выходят из зоны разделения в направлении анодного сосуда с буфером.
Рис. 41. Направления движения анионов при разделении методом КЭ. Заполненные стрелки эдектрофоретические подвижности, незаполненные — абсолютные подвижности и ЭОП.
Случай А — способ с нормальной полярностью (нормальный способ), ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В — способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен. Случай С — с переключенной полярностью и с анодным потоком, ЭОП направлен к аноду, вход заземлен.
Ситуация, обозначенная как случай А на рис. 41, приводит к распределению подвижностей, при котором детектируются только медленные анионы. На рис. 42а представлено такое распределение подвижностей для некоторых часто встречающихся анионов.
Рис. 42 а. Абсолютные подвижности при разделении анионов методом КЭ. Случай А — нормальный способ, ЭОП направлен к катоду, выход заземлен. Случай В — способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к катоду, вход заземлен.
Условия: прибор КЭ Millipore Quanta 4000; капилляр 75 мкм, 50/56 см. Поле в случае А — 600 В/см, в случае В — 600 В/см; буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, pH 6.8; ввод пробы гидростатический 4 см, 2 с; детектирование: 214 нм. Пробы — каждая по 10 мг/л: бромид — 1, хлорид — 2, сульфат — 3, нитрит — 4, нитрат — 5, азид — 6, фторид — 7, фосфат — 8, карбонат — 9, ацетат — 10, пропионат -11, бутират — 12, валериaт — 13, Д-глюконат — 14
Рис. 42 б. Абсолютные подвижности при разделении анионов методом КЭ. Случай С — способ с переключенной полярностью, ЭОП направлен к аноду, вход заземлен.
Условия: буфер — 5 мМ хромат/серная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ, pH 6.8; остальные условия те же, что на рис. 42а.
При этом абсолютные подвижности недетектируемых анионов рассчитываются по подвижности ЭОП и электрофоретической подвижности анионов (см. рис. 43).
Рис. 43. Разделение смеси анионов в случае В.
Условия: 75 мкм, 42/50 см; поде: — 600 В/см, детектирование: непрямое, 10 см, 30 с; буфер: 5 мМ хромат/серная кислота, pH 6.8; пробы: анионный стандарт, детектируются анионы с 1 до 7 (сравн. рис. 42)
Быстрые анионы удается детектировать только при переключении полярности источника напряжения (случай В). В этом случае они движутся "вверх по течению" против направления ЭОП. Однако медленные анионы выводятся из капилляра быстрым ЭОП. Это явление представлено на рис. 42а, а также в виде исходных данных — на рис. 43. В этом случае разделение тестовой смеси, включая фториды, длилось примерно 9 минут, а фосфат-ионы детектировались спустя почти 20 минут в виде очень слабого пика. Применяя аппаратуру КЭ и буфер, обращающий ЭОП и направляющий его тем самым к аноду, удается разделять быстрые и медленные анионы в одном потоке (случай С).
