Экспериментов по клонированию свиней немного. Успешные исследования провели Р. Пратер с сотрудниками в 1989 г. Скудность данных, видимо, связана с определенными трудностями работы с этим объектом.
В 1993–1995 годах, группа исследователей под руководством Я. Уилмута (Ian Wilmut) из Рослинского института получила клон овец — 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы — окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, — значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное — овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали эмбриональные и фибробластоподобные клетки плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорсет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом — 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода — на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы — на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Был использован метод электрослияния. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.
Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36 %). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода — для двух и эмбриональные клетки — четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.
Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.
Аналогичные эксперименты проводили позднее Tanja Dominko и сотрудники лаборатории Висконсинского университета, которые обеспечили клонирование эмбрионов из клеток кожи ушей взрослого рогатого скота. Эмбрионы, генетически идентичные корове, пожертвовавшей клетки уха, были внедрены в матки коров — рецепиентов. Наблюдалась постепенная гибель эмбрионов, поэтому жизнеспособных телят не получили. Причины пока не установлены.
В августе 1997 года появилось сообщение о том, что Алан Троунсон (Австралия) разработал технологию, которая позволяет сформировать эмбрион из 16, 32 или 64 клеток и затем каждая из них может использоваться для формирования 16, 32 или 64 идентичных эмбрионов. Коллектив исследователей во главе с Аланом Троунсоном создал 470 генетически идентичных эмбрионов рогатого скота от единственной бластоцисты. Такая технология обеспечивает безграничный источник генетического материала для клонирования.
Несмотря на отсутствие немедленных практических результатов сделанного открытия, теоретическую значимость его трудно переоценить. Впервые было доказано, что гены запрограммированы обратимо. Дальнейшие исследования могут позволить понять, как регулируется работа генов, дифференциация клеток, почему клетки в одних случаях растут и размножаются управляемо, а в других (при раке) — неконтролируемо.
Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Несколько коров в настоящее время беременны трансгенными телятами. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается только 5-10 % трансформированных животных, из них — несколько самцов, не дающих молока. Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин.
РЕГУЛИРОВАНИЕ ВОСПРОИЗВОДСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Воспроизводство животных — это основной фактор, лимитирующий эффективность производства животноводческих продуктов на промышленной основе. Причины, препятствующие достижению оптимальных результатов в воспроизводстве домашнего скота различны. Новые методы расширяют возможности регулирования воспроизводства. Они связаны с манипулированием на уровне клеток или эмбрионов, с использованием физиологически активных соединений, поэтому названы биотехнологическими. К числу этих методов относят: стимуляцию и синхронизацию окоты, суперовуляцию, искусственное осеменение, трансплантацию эмбрионов, хранение гамет и эмбрионов, целенаправленное получение двоен, регулирование пола, раннюю диагностику беременности, управление процессом родов, создание химер и
Стимуляция и синхронизация окоты осуществляется с помощью прогестерона — женского полового гормона стероидной природы, регулирующего ход эстрального цикла, простагландинов, а также их комбинации. Этот прием позволяет вызывать появление окоты у групп племенных животных в один и тот же период времени.
