Старение, безусловно, зависит от генетических факторов, так как каждый вид имеет характерную продолжительность жизни, но вариабельность внутри популяций по этому показателю свидетельствует также о влиянии фенотипа. При адаптировании диплоидных клеток человека (линия WI38) уже с самого начала было показано, что культивируемые клетки могут проявлять феномен старения и имеют ограниченное время жизни (50±10 удваиваний популяции). Зависящие от возраста изменения, которые при этом наблюдались, включали удлинение межмитотических интервалов (19±25 % — 31±41 %/час), изменение метаболизма, уровней ферментов и экспрессии продукта. Следует отметить, что не установлено четкой связи между продолжительностью жизни в зависимости от происхождения клетки (мышь, человек) и потенциалом удваивания их клеток в культуре.
Ограниченные по продолжительности жизни клеточные линии, например линии диплоидных клеток фибробластов, не являются идеальными объектами для целей производства, поскольку их должны использовать до того, как в клетках произойдут серьезные изменения старения. В практических отношениях это означает, что период жизни этих клеток, когда их можно применять в целях производства, заключается между 12 и 30 пассажами (в первом случае — для приготовления посевного материала). Трансформированные же клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата для генерации различных продуктов в сочетании с более высокими плотностями популяции клеток, более высокими скоростями роста и способностью расти в суспензиях.
Питательные среды и условия культивирования
После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т. е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.
Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т. д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство pH среды является одним из главных требований условий культивирования.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки. Осмоляльность раствора[73] (осмоль/кг) = Smi*xi, где mi концентрация i-гo растворенного вещества (моль/кг), хi количество частиц, на которые диссоциировала его молекула. Например, для раствора Эрла расчетная величина осмоляльности равна 310.6 мосмоль/кг, реальная 283. Диапазоны pH и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Например, для клонального роста диплоидных фибробластов человека WI38 оптимальны рН = 7.30 + 0.15 и осмоляльность 285 + 40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка 7.12 + 0.18 и 300 + 20 соответственно. Для поддержания pH в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: НСО3 = СО2 + ОН, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания pH в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне СО2-инкубатора, где pH поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0.05 Моль. Применяется в концентрациях 0.01-0.03 М.
Стандартные среды для ведения культур животных клеток. Среды Игла МЕМ (minimal essential medium) и ВМЕ (basal medium, Eagle). Чаще используется MEM. Она содержит минеральные вещества, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. MEM используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа раствор Эрла.
Среда Дульбекко DME или DMEM (двойная модификация среды Игла). Используется при культивировании клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Является основой для бессывороточных сред. Содержит двойную концентрацию аминокислот, глицин, серин, пируват, железо. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10 % концентрацией СО2.
Среда Искова IMDM — модификация среда Дульбекко. Добавлены незаменимые аминокислоты, биотин, витамин B12, селенит натрия. В среду введен HEPES и уменьшены концентрации NaCl и NаНСО3. Среда бессывороточная, обычно используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.
Среда МакКоя 5А и серия сред RPMI. Среда МакКоя 5А разработана в 1958 году для поддержания клонального роста клеток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем уже других первичных культур и различных клеточных линий. Обычно производится в модификации Ивката и Грейса (RPMI) и предназначена для культивирования лейкоцитов в присутствии сыворотки, часто применяется и для культивирования гибридом. Концентрация СО2 в атмосфере при культивировании 5 %.
Среда 199 разработана в 1950 году для культивирования фрагментов сердца из эмбриона цыпленка. Для среды характерны широкий спектр питательных веществ и невысокая их концентрация. Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5-20 % фетальной (эмбриональной) сыворотки.
Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т. д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста.
Большинство ростовых факторов присутствуют в сыворотке в концентрации нескольких нанограммов на миллилитр и ниже. Некоторые из этих факторов специфичны для клеток на определенной стадии дифференцировки, действие других не ограничено каким-либо одним типом клеток. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Например, фибробласты размножаются в ответ на фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, синтезируемый тромбоцитами и соматомедины. Все эти вещества являются митогенами (стимулируют митоз). Другим важным фактором роста практически для всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наиболее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин). Гормоны стимулируют или подавляют рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды, например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствительность к факторам роста.
