35. Кучко А.А. Гибридизация соматических клеток растений методом слияния изолированных протопластов. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 144–159.
36. Левенко Б.А., Сергеева Л.Е., Виноградов В.А., Ларькина Н.И., Миронов Е.К. Отбор и анализ устойчивых к солевому и водному стрессу клеточных линий табака и регенерантов из них. // Экспериментальная генетика растений в ускорении селекционного процесса. — Киев: Наукова думка, 1989. - с. 101–110.
37. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 78 98.
38. Методы клеточной биотехнологии растений. Киев, 1987. 53 с.
39. Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата: Наука, 1988. 168 с.
40. Милов Д., Изворска Н. Состояние и дальнейшее развитие работы с культурами in vitro. // Международный агропромышленный журнал. № 2. 1990. С. 72–78.
41. Новак Ф.Й. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значение в селекции растений. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 171–195.
42. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений. // Биология кульивируемых клеток и биотехнология. М.: Наука, 1991. С. 5–19.
43. Попов А.С. Криоконсервация клеток растений. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 70–77.
44. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной инженерии для получения посадочного материала древесных пород. Учебное пособие. М.: МГУЛ, 1993. 90 с.
45. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. /В. С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, С. В. Дегтярев и др.: Под ред. В. С. Шевелухи. М.: Высш. школа, 1998. 416 с.
46. Смоленская И.Н., Носов А.В. Методы получения и культивирования протопластов. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 164–175.
47. Уайт Ф.Р. Культура растительных тканей. М.: Иностранная литература. 1949. 160 с.
48. Урманцева В.В. Культивирование каллусных тканей на твердых средах. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 232–241.
49. Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63–69.
50. Шегебаев 0.0., Абдуллаев К.К., Жамбакин К. Ж. Генетико-битехнологические исследования в селекции пшеницы. // Биотехнология в селекции селькохозяйственных культур. Алматы, 1993. С. 28–48.
51. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии. М.: Агропромиздат, 1990. Т.2. 463 с.
52. Karabaev М., Shegebaev О. Cultivated cells of wheat and maiz: biotechnology and breeding. // Abstracts 5th International Wheat Conference June 10–14, Turkey, Ankara, 1996. P. 366.
53. Kisaka H., Kisaka М., Kanno A., Kameya T. Intergeneric somatic hybridization of rice (Oryza sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) by protoplast fusion. // Plant Cell Reports. Vol. 17, № 5. 1998. P. 362–367.
54. Kumlehn J., Schieder О., Lorz H. In vitro development of wheat (Triticum aestivum L.) from zygote to plant via ovule culture. // Plant Cell Reports. Vol. 16. № 10.1997. P. 663–667.
Культуры животных клеток
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
История метода
Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов — вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда: 1) стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2) подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области.
Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их приведены ниже.
1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.
2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.
3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.
4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.
Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.
Чуть позже, в 1885 году, У. Ру (W. Roux) показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Впоследствии он стал автором, активно публиковавшимся по проблемам эмбриологии in vitro.
Позднее, в 1897 г., Лёб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. Дополнительные эксперименты были проведены Джолли (1903), наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это при пересадке лимфосаркомной ткани собаки.
Продолжая работы Ру, Росс Харрисон усовершенствовал методику «висячей капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от медуллярного сосуда лягушки к внедренные в ее лимфатический тромб, и выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла, расположенного поверх углубления в предметном стекле. В 1907 г. ему удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток составляет 20 мкм за 25 мин. В то время как эксперименты Харрисона были направлены на то, чтобы получить ответы на вопросы, относящиеся к физиологии нервных клеток лягушки, методика, которой он пользовался, была применена Барроузом для других клеток тканей теплокровных животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба использовал тромб плазмы курицы.
В 1913 г. Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей. Примененная методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та, которую использовали Левис (1911) и Рид (1908 г.). Рид готовила культуры клеток из костного мозга морской свинки и пыталась выращивать эксплантаты на среде определенного химического состава. Работа Карреля привлекла большое внимание, так как она была опубликована под интригующим названием — культивирование «бессмертных» клеток. Инкубация клеток сердца куриною эмбриона была начала 17 января 1912 г. Пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34 года. Поскольку Каррель был хирургом и весьма сведущим в вопросах асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток животных in vitro. В то же время организация и технические условия проводимых экспериментов были очень громоздкими. Ассистенты Карреля были одеты в длиннополые резиновые халаты темного цвета с капюшонами для полного прикрытия головы. Процедуры были длительными и отягощенными многими деталями. В результате тех требований, которые выдвигались автором в отношении сложных мер предосторожности для предотвращения контаминации, вокруг данного предмета создалась атмосфера таинственности и исключительности, что скорее тормозило прогресс, чем способствовало ему. Тем не менее, им было достигнуто многое. В частности, даже при отсутствии антибиотиков он добился успеха в пересадке клеток, используя хирургическую технику для отторжения отдельных колоний и переноса их в новые условия роста. Каррель также продемонстрировал своим коллегам научное значение тех наблюдений, которые могут быть сделаны в процессе пересадки клеток.
