Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2–4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.
Преимущества метода клеточной селекции in vitro
По сравнению с экспериментальным мутагенезом на уровне целых растений метод мутагенеза на уровне клеток имеет ряд преимуществ:
— экономится площадь, так как в одной чашке Петри диаметром 10 см можно культивировать 107-108 клеток, а для такого же количества растений необходима площадь свыше тысячи гектаров;
— мутантные признаки на уровне отдельных клеток проявляются довольно быстро;
— возможно получение новых типов мутаций, в том числе и биохимического характера;
— экономится время и трудозатраты на получение нового желаемого признака.
Основным требованием для успешного использования клеточного мутагенеза является хорошо разработанная система регенерации растений. Важным условием является также возможность получения гаплоидов у того или иного вида растений. В дальнейшую селекционную работу включаются только те генотипы, у которых мутации проявляются на уровне целого растения.
Растения с измененными признаками, полученные в результате мутагенеза на клеточном уровне, называются вариантами (термин «мутант» используется тогда, когда мутация подтверждается генетическими или молекулярно-генетическими методами). Рекомендуются следующие обозначения: R0 — растения-регенеранты, полученные из соответствующих клеточных клонов, R1, R2 и т. д. — первое и последующее поколения после самоопыления.
Общая схема получения мутантных форм путем селекции на клеточном уровне состоит из нескольких этапов (рис. 17):
Рис. 17. Схема получения мутантных форм путем клеточной селекции
(по В.И. Артамонову, 1989)
Измененные при мутагенной обработке клетки могут быть выделены в условиях культивирования in vitro путем прямого и непрямого отборов, а также при тестировании отдельных клеточных колоний. Прямой отбор состоит в добавлении к питательным средам отдельных компонентов, к которым обычные, неизмененные клетки не устойчивы. Непрямой отбор (негативная селекция) заключается в создании условий культивирования, при которых рост неизмененных клеток либо задерживается, либо эти клетки погибают (например, культивирование при низких или высоких температурах на средах с недостатком отдельных компонентов и т. д.).
Существует ряд факторов, ограничивающих селекцию in vitro. Многие хозяйственно важные признаки, такие, как урожайность, количество зерна, устойчивость к пестицидам и другие трудно или практически невозможно получить при культивировании in vitro поскольку они не проявляются на клеточном уровне. Недостаточно также биохимических и молекулярных маркеров, которые коррелировали бы с этими признаками на уровне целых растений.
Не все селектируемые признаки, проявляющиеся на уровне клеток, сохраняются на уровне растений — регенерантов. Тому несколько причин: некоторая часть изменений не затрагивает генетический аппарат клетки, поэтому не сохраняется у потомков; генетические изменения могут элиминироваться в процессе дифференциации и мейоза; функция мутированного гена может быть ограничена состоянием дифференцируемых и культивируемых клеток; мутация одного гена может сопровождаться активацией различных генов, кодирующих изоферменты; часть генотипов неспособна регенерировать нормальные фертильные растения.
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ
Преимущества микроклонального размножения перед традиционными способами размножения растений. История метода.
В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба эти способа имеют как свои преимущества, так и недостатки.
К недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода.
При вегетативном размножении генотип материнского растения сохраняется, а также сокращается длительность ювенильного периода. Однако большинство видов плохо размножается вегетативным способом, к ним относятся многие древесные породы. Например, эффективность размножения, даже на ювенильной стадии, дуба, сосны, ели, орехоплодных не очень высока. Кроме того, с помощью черенкования невозможно размножать многие виды древесных растений в возрасте старше 10–15 лет. Трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции. Операции по размножению с помощью прививок сложны и трудоемки.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения. Клональное микроразмножение — получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon — черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
— получение генетически однородного посадочного материала;
— освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
— высокий коэффициент размножения (105-106 — для травянистых, цветочных растений, 104-105 — для кустарниковых древесных растений и 104 — для хвойных);
— сокращение продолжительности селекционного процесса;
— ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
— размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
— возможность проведения работ в течение всего года;
— возможность автоматизации процесса выращивания.
Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах нашего столетия получил первые растения — регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т. д. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФРа. Под руководством Р.Г.Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножении охватили и древесные растения.
Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов нашего столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro.
Но первые растения — регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.
Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т. д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).
