Литмир - Электронная Библиотека

Стерилизация посуды.

Большинство культур в лабораторных условиях выращивают в пробирках, колбах Эрленмейера различного объема и чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика[80]). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:

1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20–40 минут при температуре 100–130 °C. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы — 20–40 минут, при 1 атм. — 15 минут.

2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стаканы, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140 °C в течение 2 часов, при температуре 180 °C — 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

Стерилизация инструментов.

Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т. д.) стерилизуют в сушильном шкафу способом № 2. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают.

Стерилизация материалов.

Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25–30 мин.

Стерилизация питательных сред.

Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7–0.8 атм. при температуре 115–120 °C в течение 15–30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации[81].

Холодная стерилизация.

Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.

Как изготовить микробиологическую пробку

Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - img_60

Для предотвращения заражения культур из воздуха и их преждевременного высыхания пробирки и колбы закрывают пробками. Пробки для посуды условно можно разделить на ватные (традиционные микробиологические) и крышечки из фольги.

С ватными пробками проще работать начинающим — меньше риска получить ожог. Пробки должны плотно входить в пробирку (колбу) на 2–3 см, или на 2/3 своей длины; при открывании хорошо закрытой посуды раздается характерный хлопок.

Недостатки микробиологических пробок — довольно трудоемки в изготовлении, часто прожигаются, не очень удобны при долговременном культивировании. Если для микробиологических культур сроки культивирования редко превышают 2 недели, то для растительных клеток продолжительность субкультивирования — как минимум 3 недели. За это время среда начинает подсыхать. Поэтому в таких случаях важно закрывать ватную пробку сверху герметично парафильмом или пищевой пленкой.

Крышечка из фольги проще в работе — легко изготавливается (вырезается кружочек или квадратик по диаметру горлышка пробирки или колбы + один — полтора сантиметра для отгибания вниз).

Фольгу нужно брать плотную. Если нет плотной — тонкая фольга складывается в 3–4 раза. При обжигании краешков такой пробки нужно быть аккуратным, чтобы не получить ожог, так как фольга металлическая и хорошо проводит тепло. После одевания пробки самый краешек, загнутый вниз на пробирку или колбу, оборачивается узенькой полоской парафильма или пищевой пленки в 2–3 оборота, таким образом краешки плотно прилегают к посуде, и крышка держится надежнее, герметичнее закрывает, снижается риск контаминации (занесения посторонней микрофлоры)

Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - img_61

Изготовление микробиологической пробки

Сложить вдвое кусок марли, накрыть им верхнюю часть пробирки. На середину куска, закрывающего отверстие пробирки, положить вату, протолкнуть в пробирку на глубину примерно 3–4 см. Вату очень плотно утрамбовать, затем концы марли скрутить в центре, обвязать ниткой, лишнее обрезать. Обрезки марли можно использовать вместе с ватой при изготовлении пробок. Проверить качество пробок: хлопок в момент открывания пробирки, очень твердая ("каменная") на ощупь.

Для колб пробки готовят следующим образом: прямоугольный слой ваты скатать в виде очень плотного, до твердости валика нужных размеров, учитывая диаметр и длину горла колбы, обернуть его двойным марлевым слоем.

Не использовать пробки, изготовленные только из ваты — они легко воспламеняются при обжигании!

Работа в ламинарном боксе

Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересадкой каллусов, тканей, микроорганизмов, ведут в специальных комнатах или ламинарных боксах, где обеспечиваются стерильные условия работы. Ламинарный бокс (ламинар) приспособление для работы в стерильных условиях. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью тока воздуха. Ламинарное движение воздуха — движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Ток воздуха, проходя через ламинар, движется к исследователю[82], что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.

Подготовка бокса к работе

В специальных комнатах (микробиологических боксах) проводят влажную уборку с дезинфицирующими агентами. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами. Облучение ультрафиолетовыми лучами (260 нанометров) — наиболее часто используется в лабораториях для стерилизации помещений, настольных боксов. При длительном воздействии эти лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - img_62

Непосредственно перед работой необходимо протереть настольный бокс или внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом[83], разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, простерилизованный инструмент и посуду.

Рабочее место при отсутствии ламинара

Наличие ламинара — это отлично, просто замечательно. Но что делать, если его нет? Или появится в обозримо-необозримом будущем, а культуры клеток заводить нужно уже сейчас?

Шаг первый — постарайтесь найти малопосещаемое людскими массами помещение — чем меньше посетителей — тем меньше источников загрязнения.

Шаг второй — всегда перед работой проводите влажную уборку всей комнаты и стерилизуйте ее кварцевой (ультрафиолетовой) лампой.

123
{"b":"870463","o":1}