Этот подход, например, может позволить исследователям создать химеру так, чтобы обычный вид мог выносить плод вида, находящегося под угрозой вымирания, при этом плацента может состоять из одного набора тканей (обычного вида), а плод — из другого (вымирающего).
Химеры являются ключевым элементом создания «нокаутных» мышей, объясняющих роль генов в организме. В данном случае берут клетки, например, серой мыши, со всеми нетронутыми генами и смешивают с эмбриональными клетками белой мыши, у которой один конкретный ген удален или «нокаутирован». Такие эмбрионы развиваются в химерных мышей с мозаичным мехом, состоящим из участков «серых» и «белых» «нокаутированных» стволовых клеток. Также у некоторых химер половые железы сформированы из «нокаутированных» стволовых клеток и продуцируют яйцеклетки или сперматозоиды без одного («нокаутированного») гена. Этих мозаичных мышей можно скрещивать с нормальными мышами и получать нормальных или «нокаутированных» мышей, а сегодня (благодаря созданию условий для проведения исследований, что принесли Мартину Эвансу, Марио Капеччи и Оливеру Смитису Нобелевскую премию в 2007 году) можно создавать мутантные гены, которые активируются в определенный момент или в пределах конкретных клеток или органов как у развивающихся, так и у взрослых животных [12].
Кроме того, существуют исследования химер людей и животных, где у последних имеются человеческие клеточные признаки, например неврологические расстройства вроде Паркинсона и Альцгеймера. Можно выращивать мышей с человеческими опухолевыми клетками для изучения раковых заболеваний. Такие «аватарные» мыши имеют опухоль пациента, поэтому на них можно тестировать противораковые препараты, чтобы подобрать наиболее эффективный. Это дает преимущество, но по понятным причинам выращивание человеческих органов внутри животных вызывает тревогу, например, овца с частично человеческой печенью или мыши с человеческими нейронами, которые, как говорят, обладают повышенной способностью к обучению [13]. Я еще вернусь к этой теме и расскажу о практическом применении подобных химер.
Пирамидальные химеры
Результаты наших исследований предполагали, что клетки раннего мышиного эмбриона не обязательно идентичны друг другу, как думали почти все (включая и меня поначалу). Нам удалось проследить судьбу этих клеток, и теперь я хотела пойти дальше и проследить их развитие. Для этого я решила построить химеру, которую никто еще не создавал.
Наши наблюдения за развивающимися эмбрионами выявили два фактора, из-за которых клетки эмбриона отличаются друг от друга. Первый фактор — порядок деления клеток, поскольку клетки в двухклеточном эмбрионе делятся асинхронно, одна задругой. Согласно экспериментам, описанным в предыдущей главе, первой зачастую делится та клетка, которая унаследовала точку проникновения сперматозоида.
Второй фактор, создающий различия между клетками эмбриона, — ориентация клеточного деления. Чаще всего, в 80% случаев, одна клетка делится меридионально (вдоль анимально-вегетативной оси), а вторая — экваториально (перпендикулярно анимально-вегетативной оси). Влияет ли на судьбу клеток порядок и ориентация деления, в результате которого двухклеточный эмбрион становится четырехклеточным?
Для ответа на этот вопрос я и хотела создать химерные эмбрионы, которые состояли бы из одного типа клеток, взятых из четырехклеточного эмбриона, и понаблюдать за их развитием. Теперь, если последовать примеру коллег и допустить, что все клетки четырехклеточного эмбриона одинаковые, тогда все мои химеры должны были развиваться одинаково. Но если предположить, что я права и эти клетки разные, то каждый тип химеры должен был развиваться по-разному. Однако следовало учесть один нюанс: у нас было всего три типа клеток, а не четыре, как вы могли сразу предположить. Позвольте мне объяснить подробнее.
Причина в том, что две клетки, после деления которых получается четырехклеточный эмбрион, имеют полярность (разные концы, или полюса) или, по крайней мере, мы так считали, хотя опять же многие наши коллеги придерживались тогда иного мнения. Если клетка делится вдоль анимально-вегетативной оси, обе дочерние клетки получают и анимальный, и вегетативный полюса. Но если клетка делится перпендикулярно этой оси, то одна дочерняя клетка получит анимальный, а вторая — вегетативный полюс. Мы могли отличить эти полюса по положению второго полярного тельца, которое оставалось прикрепленным к анимальному полюсу.
Чтобы вам было легче, взгляните на полярность эмбриона следующим образом. Представьте себе двухцветный — наполовину черный, наполовину белый — мяч, расколовшийся надвое. В одном случае (при экваториальном или перпендикулярном разделении) вы получите одну черную и одну белую половины, отделяющие полюса мяча. Но если расколоть мяч под прямым углом к экватору (то есть меридионально), вы получите две идентичные черно-белые половины, поскольку каждой достанется два полюса.
Дробящийся двухклеточный эмбрион является эквивалентом двух раскалывающихся мячей. В зависимости от того, расколются они меридионально или экваториально, получатся две черно-белые клетки плюс одна белая и одна черная; или четыре черно-белые клетки; или две белые клетки и две черные. Но в природе все гораздо сложнее. Клетки делятся не синхронно, поэтому сначала поделится одна, меридионально или экваториально, затем другая, опять же меридионально или экваториально (я вернусь к этому позже).
Это и есть важный нюанс симметрии, означающий, что при делении двухклеточного эмбриона на четыре клетки получаются не четыре, а три базовых клеточных типа [14]. Чтобы установить, действительно ли эти клетки отличаются друг от друга, мы строили химеры на основе каждого из трех клеточных типов. Если обратиться к метафоре с мячом, химеры состояли из одних белых, одних черных или одних черно-белых клеток. Раз уж мы собирались провести дополнительные исследования для изучения судьбы каждой клетки четырехклеточного эмбриона, требовался изнуряющий набор экспериментов с использованием флуоресцентных красителей вместо черных и белых маркеров, чтобы идентифицировать клетки химер.
Каждый день рано утром Каролина помечала красителем (красным или зеленым) одну клетку двухклеточного эмбриона. В тот же день она наблюдала за делением. Каждые полчаса она открывала инкубатор, доставала эмбрионы и помещала под микроскоп (это было до того, как у нас появилась возможность снимать фильмы), чтобы посмотреть, какая из двух клеток поделилась первой — меченая или немеченая, и было ли это деление меридиональным или экваториальным. В зависимости от типа деления она помечала еще одну клетку вторым цветом, зеленым или красным, чтобы на четырехклеточной стадии можно было узнать происхождение каждой клетки.
В процессе деликатных манипуляций под микроскопом Каролина сделала тревожное открытие: эти клетки порой вращались относительно второй клетки во время ее деления, из-за чего можно было перепутать полюса. Чтобы избежать ошибки, мы решили, что Каролина будет помечать флуоресцентной гранулой другой конец клетки (вегетативный полюс). Так можно было гарантировать правильную идентификацию каждой клетки на стадии четырехклеточного эмбриона. Под конец Каролина «раздевала» четырехклеточный эмбрион, разделяя его на составляющие клетки, а затем из каждой индивидуальной клетки (с общей историей) создавала химеру. Этот финальный шаг следовало выполнять в предрассветные часы, когда клетки достигали данной стадии развития. Как же хотелось сказать нашим эмбрионам: «Пожалуйста, развивайтесь чуть медленнее, чтобы я поспала подольше, а позже мы наверстаем упущенное». Увы, реальность была иной.
Работать приходилось тщательно и безостановочно, и это изматывало. Каждый эксперимент занимал день и ночь, требовал кропотливых действий со стопроцентной концентрацией, чтобы создать лишь несколько химер. И разумеется, для статистической достоверности мы были вынуждены все повторять. Каждый эксперимент по созданию всех анимальных, всех вегетативных или всех анимально-вегетативных химер требовал окрашивания и наблюдения сотен эмбрионов и создания многих химерных эмбрионов, чтобы получились надежные и весомые результаты. К пяти вечера мне надо было забирать Наташу из детского сада и отвозить домой, поэтому я оставляла Каролину и отправлялась в долгий путь.
