С помощью моделей нам с коллегами удалось подсчитать, как давно жил носитель предковой мтДНК, объединяющей нас и неандертальцев. В общем случае число различий между двумя независимо существующими линиями мтДНК указывает, сколько потребовалось поколений, чтобы эти различия накопились. Если скорость мутирования известна и принимается постоянной, то число различий пересчитывается на количество поколений и, соответственно, на время. Конечно, в далеких группах животных, например у мышей и обезьян, скорость мутирования сильно разнится. Но у близких групп, таких как люди, неандертальцы и человекообразные обезьяны, скорость мутирования более или менее одинакова. Поэтому такие расчеты времени жизни последнего общего предка неандертальцев и людей (точнее, их мтДНК) вполне реальны. По нашим данным и моделям получилось, что мт-предок всех современных людей (то есть митохондриальная Ева) жила примерно 100–200 тысяч лет назад, как и было прежде подсчитано Аланом Уилсоном и его соавторами. А общий предок, а точнее прародительница, давшая начало и неандертальской последовательности, и всем современным, существовала примерно 500 тысяч лет назад. Иными словами, она старше митохондриальной Евы, праматери современного человечества, в три-четыре раза.
Чудесно! Наконец-то я окончательно убедился, что мы прочитали кусочек именно неандертальской ДНК, которая решительно отличалась от человеческой. Но теперь, чтобы опубликовать результаты, нам предстояло преодолеть третий барьер. Мы должны были найти независимую лабораторию, которая повторила бы наши результаты. Не обязательно было проверять всю последовательность целиком, достаточно было прочитать часть ее, но такую, которая бы содержала одну или несколько нуклеотидных замен, отличающих неандертальца от нас. Так или иначе, необходимо было, чтобы независимые эксперты доказали, что мы имеем дело не со странной химерой, обосновавшейся где-то в нашей лаборатории, а с настоящей ДНК из древней кости. Но к кому обратиться? Это такой тонкий вопрос…
Конечно, многие без раздумий согласились бы принять участие в подобном потенциально высокорейтинговом проекте. Но что, если в выбранной лаборатории не будет приличной технологии очистки от загрязнений, что, если они плохо знакомы с нашими методиками? У них же тогда никакая древняя ДНК не выделится и не размножится. В этом случае наши результаты будут считаться невоспроизводимыми, а значит, публиковать их нельзя. Ни в одной лаборатории, насколько я знал, не работали в таком режиме стерильности, как у нас, но все же мы остановились на группе Марка Стоункинга, специалиста по популяционной генетике в Пенсильванском университете. Я с ним познакомился в восьмидесятых в Беркли, когда работал после аспирантуры, он тоже там проходил стажировку после аспирантуры у Алана Уилсона. Марк Стоункинг был среди первооткрывателей митохондриальной Евы, он участвовал в разработке гипотезы “из Африки”. Согласно этой гипотезе люди современного типа появились в Африке 100–200 тысяч лет назад и оттуда распространились по всему миру, заместив все другие формы людей, например неандертальцев в Европе, без всякого перемешивания. Я уважал в нем проницательность и честность, к тому же с ним легко было иметь дело. А еще у него была аспирантка Энн Стоун, серьезная и целеустремленная девушка, которая раньше, в 1992–1993 годах, работала у нас в лаборатории. Она изучала мтДНК из скелетных остатков индейцев, поэтому, безусловно, была знакома с нашими методами. Если кто и сможет повторить наши эксперименты, как мне виделось, то это она.
Я связался с Марком. Как я и думал, и он, и Энн с радостью согласились попробовать, и мы разделили последний костный кусочек, переданный нам Ральфом. Сообщили Марку и Энн, какой фрагмент мтДНК они должны попытаться размножить (амплифицировать) – такой, чтобы уж точно попасть хотя бы на одну, но характернейшую неандертальскую замену. Но больше ничего им не послали – ни праймеров, ни реагентов. Только кусочек кости в запечатанной пробирке, которую не открывали с самого Бонна. Такие предосторожности сводили к минимуму вероятность переноса загрязнения из нашей лаборатории в их. И конечно, мы не сказали, в какой позиции должна найтись замена: не потому, что я не доверял Марку и Энн, а потому, что хотел подстраховаться даже от бессознательной подгонки результата. Короче, Энн должна была синтезировать праймеры и все прочее сама, ничего не зная о конечном результате. Так что, отправив быстрой почтой пробирку с косточкой, нам оставалось только ждать.
Обычно на такого рода эксперименты уходит много времени, больше, чем рассчитываешь. То праймеры вовремя не подвезут, то реактив окажется “грязным”, с человеческой ДНК, или лаборант заболевает как раз в день эксперимента, когда он должен загрузить секвенатор самыми важными образцами. Нам казалось, что мы ждали вечность. Но вот как-то вечером раздался звонок из Пенсильвании. Это была Энн. Я сразу по голосу понял, что новости не отрадные. Она нашла 15 различных вариантов того самого участка ДНК, который мы ей задали. Но все они были современные. Какое сокрушительное поражение!
Что не так? Неужели нам попалась какая-то шальная современная ДНК? Я не мог в это поверить. Если наш вариант от какого-то современного животного, то почему он так близок к человеческому? А если это все же какой-то современный человек, то очень уж странный – по ДНК у него в четыре раза больше отличий от остального человечества, чем у всех других людей между собой. А может, это какая-то старая ДНК, в которой определенные позиции особо подвержены химическим атакам неизвестной природы? Но в этом случае мы бы получили нечто похожее на современную ДНК с дополнительными изменениями и у нас бы не вышло по этой ДНК филогенетическое дерево со сколько-нибудь внятными разветвлениями. И к тому же в этом случае Энн получила бы ту же последовательность, что и мы. Вероятно все же, что у Энн в экстрактах оказалось гораздо больше загрязнений, чем у нас, и они заглушили слабый молекулярный сигнал неандертальской ДНК – это единственное логичное объяснение, какое приходило мне в голову. И что тогда делать? К Ральфу за новыми костными образцами мы больше не могли обращаться: с таким исключительно ценным материалом нужно работать наверняка, а у нас неизвестно что получится, если в этот раз мы потерпели неудачу.
И мы вот как подумали. Пусть у Энн в образцах больше загрязнений, но если она отсеквенирует тысячи молекул, то среди них найдутся и очень редкие варианты, похожие на наши. Мы, пока суд да дело, провели эксперименты и подсчитали, что наши ПЦР мы начинали с 50 молекул мтДНК. Для сравнения: пылевые частицы, которые могут быть источником загрязнений, содержат десятки, а то и сотни тысяч молекул мтДНК. Ясно, что подобная “поисковая” экспедиция с огромной вероятностью грозит обернуться неудачей.
Я обговорил эти проблемы с Матиасом. А потом мы обсудили ситуацию на лабораторном совещании, где присутствовали все посвященные в тонкости выделения древних ДНК. Я считаю подобные расширенные совещания исключительно полезными, за время своей работы я не раз убеждался в этом. Нашими удачами в поворотные моменты исследований мы обязаны именно таким собраниям. На этих встречах неожиданно рождаются идеи, которые никогда бы не пришли в голову, целиком занятую одной задачей. К тому же часто бывает, что ученый, влюбленный в свою тему или погруженный по уши в текущий проект, должен, так сказать, встретиться с реальностью, рассказать вслух и защитить свои идеи, иначе можно легко принять желаемое за действительное. Зачастую на таких совещаниях я выступаю как модератор, направляя разговор и отмечая стоящие предложения.
Вот и тогда на нашей рабочей встрече выработался план. Мы решили, что попросим Энн использовать праймеры, которые не подходят к современным ДНК, зато подошли бы к гипотетическому неандертальскому фрагменту: последний нуклеотид в последовательности праймера должен быть специфически “неандертальским”. С такого праймера современная ДНК будет стартовать и амплифицироваться с трудом, зато, найдись там неандертальская последовательность, вероятность выловить ее здорово повышается! Мы все обсудили, в особенности можно ли будет считать работу Энн независимым исследованием, ведь она будет искать с нашей подсказкой. Конечно, если бы у Энн все получилось само собой, без всякой предварительной информации, то это было бы просто превосходно. Но ведь мы собирались раскрыть ей для синтеза праймеров всего одну замену, а две другие, которые должны объявиться в последовательности, пусть останутся тайной. Мы ей не скажем. И если она их найдет, эти специфические замены, то это будет достаточным доказательством, что “наша” ДНК – настоящая, неандертальская, из косточки. На том мы и порешили, этот путь казался нам вполне обоснованным.
