Регуляция транскрипции (см. лекцию № 6).

Существенное значение в обеспечении разнообразия белков играет посттранскрипционный процессинг РНК. Основные способы такой регуляции – альтернативный сплайсинг и изменение стабильности РНК.

Известны и некоторые случаи регуляции количества и разнообразия белков путем изменения скорости процесса их трансляции. Наиболее изученный пример – синтез белков в ретикулоцитах. Известно, что на этом уровне дифференцировки кроветворные клетки лишены ядра, а следовательно и ДНК. Регуляция синтеза белка-глобина осуществляется только на уровне трансляции и зависит от содержания гема в клетке.

Ингибиторы матричных биосинтезов

Существует большая группа веществ, ингибирующих синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых заболеваний, а другие являются для человека сильнейшими токсинами. К  последним можно отнести  токсин бледной поганки α-аманитин, который является ингибитором эукариотических РНК-полимераз.

Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на:

1. модификации матриц (ДНК или РНК);

2.  белоксинтезирующего аппарата (рибосом);

3. инактивации ферментов.

Центральное место среди них принадлежит антибиотикам – разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами. Краткие сведения об антибиотиках, ингибирующих матричные синтезы, приведены в таблице 7.2.

Таблица 7.2. Антибиотики – ингибируюшие матричные биосинтезы

Антибиотики

Механизм действия

Ингибиторы репликации

Мелфалан

Алкилирует ДНК

Ингибиторы репликации и транскрипции

Актиномицин D

Встраиваются между парами оснований ДНК, блокируют синтез ДНК и РНК у про- и эукариот

Дауномицин

Доксорубицин

Новобиоцин

Ингибируют ДНК-топоизомеразу, ответственную за суперспирализацию ДНК

Номермицин

Ингибиторы транскрипции

Рифампицин

Связываются с бактериальной РНК-полимеразой

Ингибиторы трансляции

Тетрациклины

Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр

Левомицетин

Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность

Эритромицин

Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию

Стрептомицин

Ингибирует инициацию трансляции.Связывается с 50S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК

Использование ДНК-технологий в медицине

Достижения в области молекулярной биологии существенно повлияли на современную медицину: они не только углубили знания о причинах многих болезней, но и способствовали разработке новых подходов в их диагностике и лечению.

Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из биологического материала и “скопирована” (наработана) в количествах, достаточных для исследования. Для генно-терапевтических работ необходимо выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки таким образом, чтобы они экспрессировались, позволяя восстановить здоровье пациента.

Выделение ДНК включает быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, разрушение белков протеазами, экстрагирование ДНК с последующим её осаждением. В ходе выделения получают очень большие молекулы, их дополнительно фрагментируют с помощью рестриктаз. Образующиеся фрагменты разделяют методом электрофореза. Количество и длина получающихся фрагментов, и соответственно, расположение полос на электрофореграмме уникально и специфично для каждого человека.

Идентификация характерных последовательностей проводится методом блот-гибридизации по Саузерну. Фрагменты ДНК подвергают денатурации и осуществляют перенос (блоттинг) на плотный носитель (фильтр или мембрану). Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с  небольшими фрагментами ДНК или РНК, содержащими радиоактивную (флюоресцентную или др.) метку. Такие фрагменты называют ДНК- или РНК-зондами. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Метод применяется для диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов.

Секвенирование (определение первичной структуры) ДНК проводится химическим или энзиматическим методом. Метод Маскама и Гилберта (химический) основан на химической деградации ДНК. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью радиоактивной или флюоресцентной метки. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят их идентификацию. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание – его положение. Так набор полос определяет нуклеотидную последовательность ДНК.

Метод Сэнгера (ферментативный) основан на моделировании ДНК-полимеразной реакции, где исследуемая молекула ДНК используется в качестве матрицы. В реакционную смесь добавляют дидезоксинуклеотиды (ОН-группа в 3'-положении пентозы отсутствует). ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированный нуклеотид не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате элонгация данной цепи останавливается в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид. Реакция проводится одновременно в четырех отдельных пробирках, каждая из которых содержит один из четырех дидезоксинуклеотидов и все 4 дезоксинуклеотидтрифосфата (к ним, как правило присоединяют радиоактивную или флюоресцентную метку). В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида, проводят идентификацию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК.

Получение рекомбинантных ДНК и их амплификация.

При получении рекомбинантных ДНК выделяют эти молекулы из двух разных источников. Каждую из них в отдельности фрагментируют, используя одну и ту же рестриктазу. После процедуры нагревания и медленного охлаждения смеси полученных фрагментов, наряду с исходными молекулами ДНК образуются и рекомбинантные, состоящие из участков ДНК, первоначально принадлежавших разным образцам. Используя технику рекомбинантных ДНК, удаётся исследовать варианты генов, ответственных за развитие многих заболеваний. Этим способом могут быть идентифицированы различные мутации.