18 мая 1565 г. османы высадились на Мальте. Нельзя сказать, чтобы для ла Валлетта нападение было неожиданным: он заранее предпринял кое-какие меры организационного характера. На остров срочно были доставлены продовольствие и боеприпасы, съезжались боеспособные члены ордена и т.д. Но всего этого было явно недостаточно. Под началом великого магистра находилось в тот момент всего 700 рыцарей и около 7,5—8 тыс. солдат, в основном мальтийцев. Как отмечают старинные источники, «христианские государи, которых ла Валлетт молил о помощи, не спешили поддержать рыцарей», и орден вновь, как и на Родосе, оказался один на один с грозным врагом.

24 мая турки приступили к артиллерийскому обстрелу форта Сан-Эльмо, оборону которого осуществляли 120 рыцарей и отряд испанских пехотинцев. Так началась Великая осада Мальты, продолжавшаяся без малого четыре месяца (18 мая — 8 сентября 1565 г.). Гарнизон форта стоял насмерть в буквальном смысле. Только 21 июня, когда погибли все до одного его защитники, солдаты Мустафа-паши смогли занять то, что еще оставалось от небольшой крепости. За неполный месяц турецкая армия потеряла 8 тыс. человек, от шальной пули погиб один из главных командиров осаждавших — Драгут, что вкупе с другими факторами оказало на тех сильное деморализующее влияние.

Говорят, что, когда сераскер увидел руины форта Сан-Эльмо, он, со свойственной Востоку образностью, воскликнул: «Можно только догадываться, какое сопротивление мы получим от отца, если ребенок, почти младенец, стоил нам жизней самых храбрых солдат!» Под «младенцем» Мустафа-паша подразумевал Сан-Эльмо, а под «отцом» городок Биргу — резиденцию великого магистра и временную столицу ордена. Однако, подавив эмоции, военачальник Сулеймана I продолжал атаки на укрепления рыцарей.

Потери достигли внушительных размеров с обеих сторон, но если для контингента рыцарей это было смерти подобно, то турки постоянно получали подкрепление, в частности из Северной Африки. В июле наместник султана в Алжире Хасан доставил на Мальту новый отряд, насчитывавший 2 тыс. человек, и штурм сразу же возобновился. Но ни алжирцам, ни пришедшим им на помощь янычарам так и не удалось преодолеть крепостные стены.

Между тем ла Валлетт получил известие о том, что вице-король Сицилии наконец решился прийти на помощь истекавшей кровью Мальте. Защитники острова как бы обрели второе дыхание и с новым упорством отстаивали каждую пядь земли. Несколько раз военное счастье как будто было на стороне превосходящих сил противника, но смелые действия мальтийцев в тылу турецкой армии и мужество тех, кто выдерживал лобовую атаку османов, в конце концов срывали планы Мустафы-паши. С безрассудным упорством бросал он новые тысячи бессловесных солдат, на казалось бы, изнемогающих защитников фортов.

Силы ордена были на исходе, когда 7 сентября на горизонте показались сицилийские боевые корабли. С неожиданной быстротой турецкая армия, бросив на произвол судьбы свою артиллерию, погрузилась на суда, приготовившись к отплытию. Но, словно устыдившись подобной поспешности, а скорее всего, в страхе за неминуемую расплату, которая ожидала его в Стамбуле за невыполнение приказа султана, Мустафа-паша повелел вновь высаживаться на берег. Среди солдат начался ропот, жестоко подавленный привыкшим к беспрекословному повиновению сераскером.

Решающая битва между прибывшим сицилийским войском численностью 8 тыс. человек и остатками некогда мощной османской армии произошла в тот же день и завершилась убедительной победой сицилийцев. Турки окончательно ретировались: 8 сентября их флот снялся с якоря и взял курс на Стамбул. Великая осада, таким образом, закончилась. В боях погибло 25 тыс. турок, а потери ордена составили 260 рыцарей и более 7 тыс. солдат. Но несмотря на колоссальный урон, госпитальеры с полным правом могли торжествовать — ведь что бы ни делали они до этого (и какие бы нарекания они ни вызывали позже), в эти дни орден покрыл себя неувядаемой славой. Великий Вольтер заметил по поводу событий бурного лета 1565 г.: «Нет факта более известного, чем осада Мальты».

Те самые «христианские государи», которые под разными предлогами уклонились от участия в военных действиях, теперь не уставали превозносить мальтийских рыцарей до небес. Одно за другим следовали празднества в Риме, Неаполе, Мессине и Мадриде. Сын Карла V испанский король Филипп II прислал рыцарям кинжал и меч, рукоятки которых были сделаны из золота и усыпаны бриллиантами (вывезенные в 1798 г. Наполеоном, они ныне хранятся в Лувре). Не захотел отстать от него и папа Пий IV, предложивший ла Валлетту шапку кардинала — наивысшее отличие римской курии, полагая, что оказывает великому магистру неслыханную честь. Но ла Валлетт, как ни странно, отклонил столь лестное предложение: почувствовав себя героем дня и верно уловив момент, он твердо заявил, что считает себя независимым сувереном Мальты и как светский государь не может принять на себя духовное звание «более низкого ранга». Так закладывались основы будущих претензий ордена на некую великодержавность и равные права с другими европейскими монархиями.

На самой Мальте тоже ликовали. День и ночь торжественно звонили колокола церквей, пиры и гулянья пришли на смену ратным подвигам. Биргу — арена наиболее кровопролитных битв — было переименовано в Читта Витториоза («Город Победы»), а л'Исла, небольшое соседнее селение, — в г. Инвитта («Непокоренный»).

Отшумели празднества. Госпитальеры огляделись вокруг и пришли в ужас: остров лежал в руинах, следовало в который раз все начинать с нуля.

Поначалу руки опустились даже у энергичного ла Валлетта. Не лучше ли, закрались к нему в душу сомнения, бросить эту проклятую богом землю и перебраться на континент, куда, кстати, в поисках удовольствий уже отправились многие молодые рыцари. С другой стороны, великий магистр не мог не помнить годы унизительного скитания по европейским дворам в поисках постоянного пристанища, достойного «защитников христианства», героев Палестины и Родоса. Слишком дорогой ценой досталась ордену Мальта, чтобы так легко с ней расстаться.

Чаша весов все же начала склоняться к первому решению, когда из Рима прибыл в Читта Витториоза выдающийся военный архитектор Франческо Лапарелли, посланный Пием IV для строительства новой столицы ордена. Застав госпитальеров, как говорится, на чемоданах, он понял, что для раскачки у него времени нет, и уже через несколько дней представил на утверждение капитула план того города, которому и до сих пор суждено оставаться столицей Мальты.

28 марта 1566 г. великий магистр Мальтийского ордена Жан Паризо де ла Валлетт положил первый камень в основание будущего города, названного в его честь Ла-Валлеттой. Однако чувство беспокойства не оставляло его. До острова докатились слухи, что Сулейман Великолепный на этот раз лично собирался возглавить экспедицию против госпитальеров, уничтожить которых для него, «владыки Вселенной», становилось уже вопросом престижа.

Отдавая себе отчет в том, что второй раз разоренной войной Мальте турецкого натиска не выдержать, великий магистр, похоже, решается на крайние меры. Что составляет главную ударную силу Османской империи, без которой захват острова просто немыслим? Конечно же флот. А раз так, то «неверных» следует лишить флота. И вот в самый ответственный момент, когда турецкая эскадра была уже почти готова к отплытию, произошло «непредвиденное»: в Стамбуле взорвался арсенал, уничтожив бульшую часть стоявших поблизости кораблей и, таким образом, похоронив под их обломками надежды Сулеймана на быстрое отмщение.

Очередная угроза ордену миновала. Иоанниты могли наконец вздохнуть спокойно и с той же страстью, с которой они боролись против турок, приступить к мирному строительству. Но не тут-то было. Недовольство, возникшее среди молодых мальтийских рыцарей незадолго до Великой осады и приглушенное последовавшими событиями, вспыхнуло с новой силой. Причины были разные: здесь и протест против деспотизма великого магистра, и вражда между национальностями, и борьба за власть, и просто жажда удовольствий. Глухой ропот, начавшийся при ла Валлетте, перерос в открытое выступление при его менее достойном преемнике Жане л'Эвеке де ла Касспере (1572—1581).