После Арбера этой новой, интригующей областью молекулярной генетики и энзимологии заинтересовались, многие ученые. Подобные ферменты были обнаружены и в других микроорганизмах. В 1970 г. Гамильтон Смит из университета Джона Гопкинса в Балтиморе обнаружил, что рестриктаза микроорганизмов одного вида у другого вида микроорганизмов разрывает ДНК. точно в том месте, где фермент прикрепляется. Это удачное открытие вызвало взрыв активности среди ученых. К 1975г. различным группам исследователей, удалось выделить, свыше 50 рестриктаз, а сегодня, их получены уже сотни. Все они распознают и отрывают от ДНК участок, состоящий из 4—6 пар нуклеотидов. Многие рестриктазы дают возможность разрывать ДНК в разных точках и: разделять ее на различные фрагменты, содержащие определенные гены. Эти ферменты использовались не только для выделения генов, но и для составления генных карт. Такая работа была проведена в. 1971 г. Даниэлем Натансом.
Этот ученый в течение многих лет исследовал на обезьянах, один из вирусов и с помощью рестриктаз установил конкретно последовательность, действия различных генов; в конечном счете, он разобрался и в системе упорядоченности всех 5 тысяч пар нуклеотидов в. двойной спирала ДНК вируса. Это было достигнуто: с помощью 14 рестриктаз. (Для сравнения можно сказать, что ДНК человека и других высших животных имеет, по всей вероятности, свыше миллиона нуклеотидов.)
В 1972 г. Даниэль Натане стал директором, отдела микробиологии медицинского факультета университета Джона. Гопкинса, где. работал ассистентом Гамильтон Смит. Вместе со своими сотрудниками Натане разработал эффективный метод выделения в чистом виде фрагментов ДНК с помощью, электрофореза. Таким, образом, ученые уже имели «молекулярные ножницы», вырезающие нужные фрагменты из ДНК, и владели методами выделения этих фрагментов. Осталось найти «транспортное, средство», которое позволило бы вводить выделенные гены в клетку.
Такие механизмы, в сущности, были давно известны ученым. Еще в 40—50-х годах, когда закладывались основы бактериальной генетики, было открыто явление трансдукции (переноса генов из одной клетки в другую с помощью вируса). Ген прикрепляется к ДНК вируса, которая впоследствии становится частью хромосомы бактерии. Разумеется, этот механизм действовал лишь у вирусов, которые не уничтожают клетку сразу. Другой механизм связан с процессом полового размножения бактерий. Клетки нормально обмениваются генетическим материалом с помощью плазмид (небольших частиц, содержащих фрагменты ДНК). Если ввести в плазмиды какой-либо ген, то они превращаются в отличное «транспортное средство», переносящее ген в бактерии.
Создание и развитие генной инженерии, как и любой новой области науки, было результатом деятельности большого числа ученых и групп исследователей. Но всегда среди многих можно выделить лиц, внесших решающий вклад. Вернер Арбер открыл рестриктазы, Гамильтон Смит выделил первые рестриктазы, а Даниэль Натане создал метод выделения генов и провел с помощью рестриктаз полное исследование вирусного генома. За свои замечательные научные достижения трое названных исследователей были удостоены в 1978 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине.
В числе основоположников генной инженерии стоит и имя Пола Берга из Станфордского университета. В 1972 г. путем химического воздействия он сумел соединить ДНК двух вирусов, получив молекулярный гибрид. Эта методика оказалась очень полезной, так как дала возможность присоединять различные гены к вирусу, используя его как транспортное средство для проникновения в клетку. Таким образом, возникли предпосылки для создания генных «библиотек». Гены, выделенные из самых различных организмов, могут вводиться в клетки бактерий с помощью фагов или плазмид и размножаться вместе с бактериями. Эти бактерии служат фондом генной «библиотеки», и при необходимости из них всегда можно извлечь ген, представляющий интерес для исследователя. Кроме того, гены, перенесенные в необычную среду, начинают действовать по-иному, и это создает возможность для изучения механизма их регуляции.
Важной проблемой в молекулярной биологии является определение нуклеотидной последовательности в ДНК. Больших успехов в этой области добился Фредерик Сенгер, опытный экспериментатор, который в середине 50-х годов разработал метод определения аминокислотной последовательности белков и в 1958 г. получил Нобелевскую премию по химии за определение структуры инсулина.
В 1965 г. Сенгер начинает в Кембридже (где он постоянно работал) исследование структуры нуклеиновых кислот, в частности первичной структуры (нуклеотидной последовательности). С этой целью использовались меченые атомы, что позволило работать с ничтожно малым количеством экспериментального материала — порядка микрограммов. Исследовалась реакция синтезирования второй комплементарной цепи, меченной радиоактивным фосфором, на матрице однониточной ДНК. Она осуществлялась в ходе четырех параллельно идущих опытов, в которых у каждого нуклеотида прерывался рост цепи. Полученные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза, что дает возможность точно определить длину конечного полинуклеотида. В каждом из четырех опытов реакция останавливалась соответственно на аденине, гуанине, цитозине и тимине. Зная фрагменты и число нуклеотидов в них, можно точно определить место каждого из этих оснований в молекуле ДНК.
Этот метод Сенгер с сотрудниками применили в 1977 г. для определения положения 16 500 нуклеотидов в ДНК митохондрий человека. Эти клеточные субстанции, генераторы энергии клетки, имеют собственную ДНК и относительную автономию. Предполагается, что они, как и хлоропласта, произошли от симбиотических микроорганизмов, приспособившихся к жизни в клетке. В группе, руководимой Сенгером, были разработаны и другие методы исследования нуклеиновых кислот, с помощью которых еще в 1967 г. удалось определить нуклеотидную последовательность одного из видов РНК, состоящей из 120 нуклеотидов, а в 1977 г. на двух страницах английского журнала Nature был напечатан петитом список всех 5375 нуклеотидов ДНК фага ФХ174: химическая формула бактериофага.
В 1977 г. Уолтер Гилберт из Гарвардского университета предложил новый метод определения места нуклеотидов, основанный на разрыве ДНК по определенному нуклеотиду. Начало этому методу было положено еще в 1966 г. совместной статьей Гилберта, его сотрудника Э. Максама и советского ученого А.Д. Мирзабекова[28]. Советские ученые внесли значительный вклад в развитие этой методики. А.Д. Мирзабеков, А.М. Колчинский и А.Ф. Мельникова предложили метилировать аденин и гуанин, после чего разрывать ДНК, используя реакции с метилированными соединениями. Гилберт и Максам развили метод и открыли отдельные реакции, которые разрывают ДНК в определенных местах у каждого из четырех оснований. При этом получаются фрагменты, которые исследуются также методом электрофореза.
Предварительным этапом в определении нуклеотидной последовательности является разрезание ДНК с помощью рестриктаз. Образующиеся фрагменты состоят из нескольких тысяч нуклеотидов, которые, в сущности, представляют собой отдельные гены. Так, шаг за шагом раскрывается молекулярная структура ДНК бактерий, растений и животных. Со временем, вероятно, будет определена и нуклеотидная последовательность ДНК человека, для записи которой потребуется, по-видимому, несколько томов. Тогда, быть может, и претворятся в жизнь слова Винера о «передаче человека по телеграфу».
Современные научные исследования — это, как правило, плод коллективного труда. Нобелевская премия, однако, индивидуальна, и ею награждаются лишь главные участники и вдохновители исследований. Пол Берг, Фредерик Сенгер[29] и Уолтер Гилберт были удостоены Нобелевской премии по химии в 1980 г., и это символизировало признание крупных успехов, достигнутых многими учеными в области генной инженерии и молекулярной генетики.
