Весной 1513 года к Рафаэлю обратился от имени монашеского ордена бенедиктинцев упоминавшийся выше гуманист Грегорио Кортезе из Модены, который полемизировал когда-то с Полициано по поводу стиля Цицерона. Он предложил написать образ для главного алтаря церкви Святого Сикста в городе Пьяченца по случаю завершения реставрации храма, где хранятся мощи канонизированного папы Сикста II, занимавшего престол с 357 по 358 год, и мученицы святой Варвары. Предложение было тогда горячо поддержано папой Юлием II, высоко чтившим мученика Сикста. Во время скоротечной болезни папа через Эджидио да Витербо изъявил желание, чтобы алтарный образ святого Сикста украсил часовню с его надгробием, так как сам он давно утратил интерес к задуманному Микеланджело грандиозному мавзолею. Таким образом, вновь могли бы перехлестнуться интересы двух великих соперников. Но после кончины папы Юлия идея на время была отложена, тем более что ждали своего завершения росписи в ватиканских станцах, где появился новый хозяин, и вся команда Рафаэля целиком переместилась в четвёртый и самый просторный зал, главной темой которого была победа Константина над императором Максенцием, утонувшим в Тибре. Все росписи были выполнены учениками по эскизам мастера. Но на одной из нижних фресок, исполненной им самим, запечатлён строящийся собор Святого Петра, каким хотел его видеть Рафаэль.

Он не забывал об обещании, данном монахам из Пьяченцы, и всякий раз, берясь за очередной заказ, думал о «Мадонне со святым Сикстом». К её написанию он долго готовился, но рисунки до нас не дошли, словно картина писалась прямо на холсте по заранее обдуманному плану, вобрав в себя все прежние наработки и удачные находки. А может быть, Рафаэль хранил в тайне всю подготовительную работу, ибо он рассматривал задуманную Мадонну как акт покаяния за всё дурное и за допущенные просчёты? Это было глубоко личное творение. В ходе работы над ним он близко никого к себе не подпускал. Хотя алтарные образы традиционно писались на доске, этот написан на холсте. Новая Мадонна, получившая название «сикстинской», стала итогом его раздумий и исканий идеального женского образа, не дававшего ему покоя. К нему он шёл, начиная чуть ли не с отроческого возраста, когда написал первую фреску на стене отчего дома.

Вспомнив деда Санте, построившего себе за городом домик, чтобы слиться с природой, Рафаэль неподалёку от виллы Боргезе за крепостной стеной, воздвигнутой во времена Марка Аврелия, облюбовал себе спокойный уголок с домиком. Его стала угнетать городская и дворцовая суета, и он решил укрыться, дабы побыть наедине со своими думами на лоне природы. С помощью Бавьеры домик был приспособлен под мастерскую для работы над большим холстом, набитым на подрамник (269,5x201 сантиметр). Временные отлучки из мастерской для всех были тайной. Наняв пролётку, художник объяснял ученикам и знакомым, что нуждается в свежем воздухе на приволье. В округе его временное убежище долго значилось как вилла Рафаэля, хотя после написания картины он там больше не показывался. В 1849 году во время франко-австрийской интервенции и штурма Рима дом был разрушен.

В отличие от ватиканских «Коронования Девы Марии» и «Мадонны Фолиньо» Рафаэль здесь полностью порывает с землёй. Если бы он создал одну лишь «Сикстинскую мадонну», этого было бы достаточно, чтобы мир считал его величайшим живописцем всех времён. Прежде чем отправить картину заказчику, её выставили в одном из дворцовых залов, где ею могли полюбоваться придворные, римская знать и дипломатический корпус при Ватикане. Задумавшись, папа долго сидел перед картиной, но по его бесстрастному лицу трудно было угадать его чувства. Зная о завистливой натуре Льва X и его приближённых, Рафаэль сделал всё от него зависящее, чтобы картина скорее покинула Рим. Это была последняя возможность показать столичной публике рафаэлевский шедевр в течение трёх дней. Оказавшись в провинциальной Пьяченце, насчитывавшей не более пятнадцати тысяч жителей, «Сикстинская мадонна» в течение более двух с половиной веков пребывала в безвестности, покрываясь копотью от горящих свечей перед алтарным образом церкви Святого Сикста, пока в 1754 году монахи-бенедиктинцы не продали её саксонскому курфюрсту Августу III и она оказалась в его резиденции в Дрездене, где обрела постоянное местожительство. Но слава о «Сикстинской мадонне» разнеслась по всему свету благодаря снятым с неё гравюрам, которые пользовались большим спросом.

Первая и признанная самой удачной была гравюра Ф. Мюллера, появившаяся в 1815 году и вызвавшая в Европе всеобщее восхищение. Было ещё множество копий, но при всей их добротности и верности оригиналу не удалось передать волшебство притягательной силы рафаэлевского творения.

Долгое время считалось, что «Сикстинская мадонна» должна была висеть над надгробием Юлия II, чем объясняется появление Девы Марии из-за распахнутого занавеса. Это мнение подтверждалось также присутствием мученицы Варвары как пособницы людям в смертный час и папы Сикста II, признанного покровителя клана делла Ровере, чья эмблема жёлудя с дубовыми листьями присутствует в композиции. Высказывалось предположение, что в образе святого Сикста изображён папа Юлий II, с чем трудно согласиться, вспомнив блистательный портрет Юлия кисти Рафаэля, преисполненный сдержанной энергии и благородства мудрого политика, что не идёт ни в какое сравнение с дрожащим от волнения взлохмаченным стариком с прекрасно написанным профилем в момент наивысшего потрясения при виде Богоматери с Младенцем, что заставило его снять перед ней тиару.

Рафаэль лишил тему Богоявления её церковного налёта, выявив тем самым заключённый в ней глубоко гуманный смысл. В итальянской живописи тема Божественного явления получила широкое распространение. Показ таинственного и сверхъестественного был лишь поводом и данью традиции, зародившейся еще в римских катакомбах в годы гонения на христиан. Главное — это силой искусства вызывать глубокое потрясение самой картиной, раскрывающей сущность бытия, и порождать в душах чувства, близкие к катарсису.

«Сикстинская мадонна» — это самый возвышенный поэтический образ Мадонны в искусстве Возрождения, равно как и «Владимирская Богоматерь» в средневековом искусстве. Их отличие в том, что на византийской иконе Богородица смотрит на мир с печалью и немой укоризной, сознавая, на какие муки обречено её дитя, а Мадонна Рафаэля перед лицом грядущих испытаний внешне сохраняет спокойствие, нескрываемую радость материнства, но и решимость пройти жертвенный путь до конца.

На картине изображено мимолётное видение — тяжёлый занавес отдёрнут и перед зрителем предстаёт шествующая лёгкой поступью по облакам Мадонна с нежно прижатым к груди Младенцем в сопровождении святой Варвары и папы Сикста II. Но у Рафаэля она явилась людям не для того, чтобы призывать их к покорности и самоотречению в канун потрясших Европу религиозного фанатизма, нетерпимости и суеверия, чьи отголоски нашли отражение в некоторых поздних творениях Рафаэля. Он предчувствовал наступление мрачных сумерек и предпринял неимоверное усилие, чтобы выразить жизнеутверждающую гармонию добра, человеколюбия и подвести итог славному пути, пройденному им самим и его собратьями по искусству Возрождения.

«Сикстинская мадонна», словно озарённая божественным светом, предстаёт олицетворением высокого человеческого достоинства, которое художник завещал хранить потомкам. Выше «Сикстинской мадонны» по красоте и глубине философского замысла Рафаэль больше ничего не создал. На прекрасном лице Мадонны, сияющем идеальной девственной чистотой, отражается душевное волнение, вызванное возложенной на неё миссией. Она в смущении смотрит на мир, которому должна принести великую жертву. На её лице можно даже разглядеть искорку надежды, что уготованная чаша минует её дитя. Сидящий на руках очаровательный Младенец со спутанными волосами на взлохмаченной головке с недоверием смотрит на мир, куда ему предстоит сойти.

Поразительная лёгкость поступи Мадонны в безграничном пространстве достигается контрастом между чистотой её силуэта, очерченного слева непрерывной линией, и изгибающегося справа под взлётами плаща на ветру. Её маленькие ступни находятся в тени, еле касаясь облаков, пронизанных ярким светом, что ещё больше усиливает ощущение мягкости поступи. Продуманное расположение складок на картине, которым отведена важная роль, показывает, насколько глубоко Рафаэлем был усвоен урок античного искусства. Ощущение движения на картине усиливается складками откинутого у ног Мадонны плаща и вздувшимся над её головой покрывалом, создающим иллюзию, будто Дева Мария не идёт, а вплывает в пространство из глубины облаков под действием влекущей её божественной силы. С движением складок плаща Мадонны согласуется изогнутый край облачения Сикста и складки одежды Варвары.